Mutaciones que afectan a regiones no codificantes Flashcards
Secuencias de consenso que determinan el principio y el final del intrón
● Principio: GT . 5’ splicing site
● Final: AG . 3’ splicing site
Formación del spliceosoma
Una serie de ribonucleoproteínas reconocen estas secuencias y se unen formando un complejo, el spliceosoma.
Función spliceosoma
Elimina los intrones y une los dos exones. El intrón se va, el complejo se deshace, se degrada el intrón y se forma el mRNA maduro.
Downstream del sitio de splicing 5’ hay
Un tracto de poli-pirimidinas (Y, pirimidina = poli-Y)
Upstream a la poliY, encontramos
Una Adenina, punto de ramificación
Mecanismo de splicing
En un intrón el AG y GT tienen que quedar espacialmente cerca —> spliceosoma se une al branch point (A) y acerca los extremos para que entren en contacto = lazo.
Exón 1 (extremo 5’) queda cerca del siguiente exón. Ataca al enlace fosfodiéster del extremo 3’, lo rompe, y se unen.
Liberación del intrón en forma de circular RNA, unido a lo que era el spliceosoma —> RNA intrónico participa en procesos posteriores y luego se degrada.
Importancia del splicing
Permite que un gen genere distintos mRNA, distintas proteínas, con una misma capacidad codificante
Cada gen genera
4 transcritos alternativos distintos, de promedio, con distintos exones.
Patrón de splicing
Cambia de un tejido a otro (= gen puede tener distinta expresión)
- exón cassette: puede cambiar todo el marco de lectura a partir de este
- exones que son mutuamente excluyentes: si uno está presente, el otro no permanecerá en el mRNA y viceversa.
Factores que regulan el splicing
Ribonucleoproteínas
Enhancers y silencers
Ribonucleoproteínas
snRNP U1, snRNP U2, U2AF
Se unen a cada una de las secuencias de consenso = spliceosoma.
(Se van plegando siempre igual, dejando una serie de dominios, que son catalíticos, a la vista —> reconocen regiones por complementariedad de bases y se unen)
U1 se unirá a
Región de splicing 5’, de bases GU (GT en el DNA).
U2 siempre se unirá a
Región branch point donde se encuentra la Adenina (A)
U2AF se unirá a
Dominio de 65 kD U2AF se unirá a las poli-pirimidinas (poli-Y)
Dominio de 35 kD U2AF se unirá a la región splicing 3’ (AG)
¿Cómo es posible que la célula sólo reconozca como sitios de splicing esos GT y AG, si hay un montón por todo el genoma?
i. Contexto de secuencia que les hace + fuertes y + propensos al splicing.
ii. Estas señales básicas están reforzadas por otros tipos de señales: enhancers o silencers del splicing
Intronic splicing enhancer
Secuencias de nucleótidos que actúan como potenciadores del splicing.
Hace que las señales sean fuertes.
Intronic splicing silencer
Secuencias de nucleótidos que actúan como silenciadores del splicing. A ellos se unen proteínas que impiden que se estabilice el spliceosoma.
Exonic splicing enhancers and silencers
Secuencias de nucleótidos que actúan como sitios de unión para proteínas. Algunas de estas potencian el spliceosoma y otras lo inhiben.
Proteínas que se unen a los exonic splicing enhancers and silencers
HnRNPs: proteínas que se unen a los silenciadores (compite por el sitio de unión de U2AF)
SR (serina - arginina): se une a los enhancers de splicing y favorece la unión de las secuencias consenso de splicing al spliceosome.
Efectos mutación sinónima
No cambia la proteína pero puede afectar al splicing por no encajar con el sitio de unión del enhancer / silenciador.
Las mutaciones sinónimas no siempre son neutras.
Posibles mutaciones que alteran el mecanismo de splicing
Mutación que afecta al sitio de splicing 3’ (AG)
Mutación que afecta al sitio de splicing 5’ (GT)
Exonización de elementos Alu
Presencia de secuencias crípticas intrónicas
Presencia de secuencias crípticas exónicas
Mutaciones en los nucleótidos que rodean las secuencias consenso de splicing
Mutación que afecta al sitio de splicing 3’ (AG)
- Exonización intrón 1: gran exón 1, splicing no ocurrirá y pasa al del siguiente = proteína más larga —> muy probable frameshift (proteína larga y truncada)
- Intronización exón 2 (“exon skipping”) : más probable, intrón 1 al no tener secuencia de terminación busca la del intrón 2 (exón 2 se introniza) = proteína más corta —> muy probable frameshift (proteína corta y truncada)
Mutación que afecta al sitio de splicing 5’ (GT)
- Exonización del intrón 1
- Exon skipping.
No siempre cada exón termina justo al final del codón
Puede pasar que, al eliminarse un exón, no cambie el marco de lectura pero quitarse o añadirse nucleótidos, se completa el codón del exón anterior con un nuevo nucleótido = esto puede dar lugar a codones de stop prematuros, mis-sense mutations,…
Exonización de elementos Alu
Alu elements = repeticiones en el DNA. Los intrones están plagados de estos.
Alu tienen regiones que pueden funcionar muy bien como secuencia de consenso. Son regiones a las que se podría unir el U2AF, pero tiene más afinidad por ellas el HnRNP C, inhibidor de splicing. Mutación = se pierde esta silenciación —> parte del Alu se exoniza, y se añade así una secuencia mala, no codificante
Presencia de secuencias crípticas intrónicas
Situación: muta AG (3’) y si ese intrón 1 contiene una secuencia de splicing críptico = nuevo sitio de splicing decente.
Es + débil que la secuencia original pero sirve —> exón 2 = + largo. Se añaden + Aa = proteína + larga con mucha probabilidad de que se de frameshift.
(Parte del intrón 1 se exoniza al exón 2)
Presencia de secuencias crípticas exónicas
Situación: muta la terminación AG con + afinidad por el spliceosoma. No está el original —>se utiliza este nuevo sitio críptico (afinidad + débil pero decente).
Al encontrarse en el exón el nuevo sitio de splicing 3’ —> intrón + largo y exón 2 = + corto. Se pierden Aa = prot + corta y además, si no se pierden 3 o nº de Aa múltiplo de 3, cambiará el frameshift.
(Consiste en una intronización del exón 2)
Nomenclatura mutaciones upstream al exón
Se designa con un signo “+” para decir que está a la derecha del exón en cuestión.
Nomenclatura mutaciones downstream al exón
Se designa con un signo “-” para hacer referencia a los nucleótidos de la izquierda del exón, en el intrón del extremo 3’ (previos a la siguiente secuencia exónica de coding DNA)
