H3.7: Proteomics, metabolomics, miRNA's en RNAi screens

Question 1

waardoor wordt de hoeveelheid actief eiwit bepaald?

Answer 1

• hoeveelheid mRNA
• hoe goed wordt het mRNA vertaald naar eiwit?
• wordt het eiwit geactiveerd of afgebroken?

Question 2

expressieprofiel bepalen van eiwitten is lastiger dan van mRNA, maar je leert er meer van

Question 3

wat kan je van eiwitten allemaal analyseren?

Answer 3

• eiwit-identificatie
• -modificatie
• -interactie

Question 4

eiwit identificatie met massa spectrometrie stappen:

Answer 4

1: eiwit(/-mengsel): groot
2: trypsine digestie: maakt er kleinere stukjes van (deze heten tryptische fragmenten)
3: kleinere stukjes worden adhv massa spectrometrie geanalyseerd
4: data vergelijken met humane genoom project
5: identificatie van het eiwit

Question 5

trypsine

Answer 5

• enzym dat in onze darmen voorkomt
• helpt met afbraak van eiwitten tot aminozuren

Question 6

waar knipt trypsine?

Answer 6

specifiek bij:
- arginine (R)
- Lysine (K)

Question 7

hoe werkt de massa spectrometer?

Answer 7

1: je hebt dus een mengsel met al die peptides
2: deze peptides worden op een sample plaat aangebracht
3: met een laser wordt een hele korte puls erop geschenen
4: hierdoor raakt een deel van de peptides positief geladen (1+)
5: de sampleplaat is ook positief geladen. dus de peptides willen weg van de positief geladen plaat richting een negatief geladen plaat
6: een deel van de peptides raakt in de gasfase. deze vliegen van de positieve plaat naar de negatieve
7: in de negatief geladen plaat zit een gat waar ze doorheen kunnen vliegen totdat ze een detector raken
8: als er een peptide op de detector komt, wordt er een signaal afgegeven

Question 8

de snelheid waarmee de peptides vliegen is afhankelijk van…

Answer 8

• lading
• massa

Question 9

kleine moleculen snelheid

Answer 9

hoger

Question 10

hoe wordt de massa van de peptides bepaald met massa spectrometer?

Answer 10

op basis van de tijd die de molecuul erover doet om op de detectorplaat te komen (want je weet de lading)

Question 11

je weet nu de massa. en dan?

Answer 11

je weet ook hoe zwaar aminozuren zijn..

Question 12

humane genoom database en massa spectrometrie data

Answer 12

in docu

Question 13

wat kan massa spectrometrie allemaal?

Answer 13

• eiwitten identificeren
• eiwitten kwantificeren (iets moeilijker)
• bindende eiwitten identificeren
• eiwitmodificaties identificeren (bv fosforyleren)

Question 14

hoe kan massa spectrometer bepalen welke eiwitten binden (eiwit-interacties)?

Answer 14

stel je wil weten wat er gebonden is aan een p53 eiwit.
1: je maakt een antilichaam specifiek bindend aan dat p53 eiwit
2: dit voeg je toe, waardoor je een complex krijgt van p53 met dat antilichaam en eventuele aangebonden eiwitten
3: dat antilichaam kan je uit de oplossing vissen
4: dit doe je in de massa spectrometer

Question 15

hoe gebruik je massa spectrometrie voor het uitvinden van eiwit modificaties?

Answer 15

stel je wil weten welke andere eiwiten het ABL-BCR fusie eiwit activeert (=fosforyleert).
1: je begint weer met een eiwitmengsel. dit bevat zowel cellen met het ABL-BCR gen als zonder en je wil dus weten wat het verschil is tussen die twee aan peptiden die gefosforyleerd zijn
2: trypsine …
3: we zijn speciaal geïnteresseerd in eiwitten die een fosfaatgroep hebben. je voegt hiervoor een extra stap toe tussendoor (hoef je voot tt niet te weten)
4: identificeren adhv massaspectrometer
dit was (1), nu (2)

Question 16

(2)

Answer 16

1: je herkent een bepaalde peptide op de massaspectrometer adhv molecuul massa. nu wil je dus weten of dat gefosforyleerd is.
2: een fosfaatgroep is precies 80 dalton groot
3: je zoekt dus naar een piek die de massa heeft van de bekende peptide + 80
4: als je die vind, weet je dus dat dat ABL-BCR eiwit ook dat peptide/eiwit fosforyleert

Question 17

hoe kijk je naar de activiteit van het eiwit zelf?

Answer 17

bv door te kijken naar metabolieten zoals suiker, nucleotiden, aminozuren . allemaal moleculen die gemaakt worden door eiwitten (enzymen) . ; metabolomics in het bloed

Question 18

hoe werkt metabolomics? (kijken in het bloed of er een tumor ergens is)

Answer 18

een van de hallmarks is dus dat tumorcellen het metabolisme helemaal vergooien. dus als je veel cellen met een gedereguleerd metabolisme hebt, is dat dus een teken.
1: metabolomics hoeven niet met trypsine bereid te worden want deze zijn sws al klein
2: direct het mengsel in de massa spectrometer
3: weer precies hetzelfde
4: je kan dan identificeren welke moleculen dat zijn OF je vergelijkt het van een kanker patient met een niet-kanker patient qua pieken
5: dat patroon kan evt. worden gebruikt om de tumor op te sporen voordat hij echt problemen geeft bij de patient

Question 19

waarom is mRNA niet altijd voorspellend voor eiwit(activiteit)?

Answer 19

• het kan zijn dat de translatie gereguleerd is
• het kan een regulatie zijn van eiwitstabiliteit (dus het kan zijn dat eiwitten wel worden gemaakt maar ook weer worden afgebroken)
• regulaite van eiwitmodificaties (bv fosforylering)

Question 20

hoe gebeurt translatie van een mRNA?

Answer 20

ribosoom

Question 21

hoe worden ribosomen gereguleerd?

Answer 21

systeem van microRNA’s

Question 22

je hebt ook genen die alleen maar coderen voor RNA

Answer 22

bv microRNA genen. deze hebben ook gewoon een promotor etc en worden afgelezen en gemaakt en dan heb je een pri-microRNA (primair)

Question 23

pri-miRNA

Answer 23

stukje RNA met een aantal soort van terug in zichzelf vouwingen

Question 24

regulatie van translatie

Answer 24

je hebt dus pri-miRNA.
1; in de celkern wordt dit geknipt in kortere fragmenten door het Drosha-complex waardoor het daarna pre-miRNA wordt
2; dit pre-miRNA gaat vervolgens naar het cytoplasma
3; daar zit een ander enzym: Dicer
4; Dicer knipt het pre-miRNA naar nog wat kleinere stukjes => mature miRNA
5; hiervan wordt 1 streng ingebouwd in een complex dat het RISC complex heet
6; het RISC complex samen met een miRNA kan binden aan mRNA (mRNA en miRNA zijn complementair en RISC helpt hierbij
7: dit vermindert de translatie van het mRNA door ribosomen of het leidt zelfs tot afbraak van het mRNA

Question 25

dus even regulatie van translatie samengevat

Answer 25

• miRNA transcriptie
• Drosha knipt het tot pre-miRNA
• transport naar cytoplasma
• dicer knipt het tot miRNA
• 1 streng wordt ingebouwd tot RISC compelx
• miRNA zorgt voor specificiteit, eiwitcomponenten zorgen voor repressie van translatie of mRNA afbraak

Question 26

dus mRNA en miRNA zeggen samen iets over hoeveel eiwitten er worden getransleerd

Question 27

door zelf miRNA in cellen te brengen, kan je dat RISC compex forceren en een mRNA naar wens uitzetten

Question 28

RNA interferentie (RNAi)

Answer 28

• remt mRNA
• heel specifiek
• door het mRNA op verschillende plekken met siRNA’s aan te pakken, zal resistentie niet gemakkelijk ontstaan