H3.7: Proteomics, metabolomics, miRNA's en RNAi screens Flashcards
waardoor wordt de hoeveelheid actief eiwit bepaald?
- hoeveelheid mRNA
- hoe goed wordt het mRNA vertaald naar eiwit?
- wordt het eiwit geactiveerd of afgebroken?
expressieprofiel bepalen van eiwitten is lastiger dan van mRNA, maar je leert er meer van
wat kan je van eiwitten allemaal analyseren?
- eiwit-identificatie
- -modificatie
- -interactie
eiwit identificatie met massa spectrometrie stappen:
1: eiwit(/-mengsel): groot
2: trypsine digestie: maakt er kleinere stukjes van (deze heten tryptische fragmenten)
3: kleinere stukjes worden adhv massa spectrometrie geanalyseerd
4: data vergelijken met humane genoom project
5: identificatie van het eiwit
trypsine
- enzym dat in onze darmen voorkomt
- helpt met afbraak van eiwitten tot aminozuren
waar knipt trypsine?
specifiek bij:
- arginine (R)
- Lysine (K)
hoe werkt de massa spectrometer?
1: je hebt dus een mengsel met al die peptides
2: deze peptides worden op een sample plaat aangebracht
3: met een laser wordt een hele korte puls erop geschenen
4: hierdoor raakt een deel van de peptides positief geladen (1+)
5: de sampleplaat is ook positief geladen. dus de peptides willen weg van de positief geladen plaat richting een negatief geladen plaat
6: een deel van de peptides raakt in de gasfase. deze vliegen van de positieve plaat naar de negatieve
7: in de negatief geladen plaat zit een gat waar ze doorheen kunnen vliegen totdat ze een detector raken
8: als er een peptide op de detector komt, wordt er een signaal afgegeven
de snelheid waarmee de peptides vliegen is afhankelijk van…
- lading
- massa
kleine moleculen snelheid
hoger
hoe wordt de massa van de peptides bepaald met massa spectrometer?
op basis van de tijd die de molecuul erover doet om op de detectorplaat te komen (want je weet de lading)
je weet nu de massa. en dan?
je weet ook hoe zwaar aminozuren zijn..
humane genoom database en massa spectrometrie data
in docu
wat kan massa spectrometrie allemaal?
- eiwitten identificeren
- eiwitten kwantificeren (iets moeilijker)
- bindende eiwitten identificeren
- eiwitmodificaties identificeren (bv fosforyleren)
hoe kan massa spectrometer bepalen welke eiwitten binden (eiwit-interacties)?
stel je wil weten wat er gebonden is aan een p53 eiwit.
1: je maakt een antilichaam specifiek bindend aan dat p53 eiwit
2: dit voeg je toe, waardoor je een complex krijgt van p53 met dat antilichaam en eventuele aangebonden eiwitten
3: dat antilichaam kan je uit de oplossing vissen
4: dit doe je in de massa spectrometer
hoe gebruik je massa spectrometrie voor het uitvinden van eiwit modificaties?
stel je wil weten welke andere eiwiten het ABL-BCR fusie eiwit activeert (=fosforyleert).
1: je begint weer met een eiwitmengsel. dit bevat zowel cellen met het ABL-BCR gen als zonder en je wil dus weten wat het verschil is tussen die twee aan peptiden die gefosforyleerd zijn
2: trypsine …
3: we zijn speciaal geïnteresseerd in eiwitten die een fosfaatgroep hebben. je voegt hiervoor een extra stap toe tussendoor (hoef je voot tt niet te weten)
4: identificeren adhv massaspectrometer
dit was (1), nu (2)
(2)
1: je herkent een bepaalde peptide op de massaspectrometer adhv molecuul massa. nu wil je dus weten of dat gefosforyleerd is.
2: een fosfaatgroep is precies 80 dalton groot
3: je zoekt dus naar een piek die de massa heeft van de bekende peptide + 80
4: als je die vind, weet je dus dat dat ABL-BCR eiwit ook dat peptide/eiwit fosforyleert
hoe kijk je naar de activiteit van het eiwit zelf?
bv door te kijken naar metabolieten zoals suiker, nucleotiden, aminozuren . allemaal moleculen die gemaakt worden door eiwitten (enzymen) . ; metabolomics in het bloed
hoe werkt metabolomics? (kijken in het bloed of er een tumor ergens is)
een van de hallmarks is dus dat tumorcellen het metabolisme helemaal vergooien. dus als je veel cellen met een gedereguleerd metabolisme hebt, is dat dus een teken.
1: metabolomics hoeven niet met trypsine bereid te worden want deze zijn sws al klein
2: direct het mengsel in de massa spectrometer
3: weer precies hetzelfde
4: je kan dan identificeren welke moleculen dat zijn OF je vergelijkt het van een kanker patient met een niet-kanker patient qua pieken
5: dat patroon kan evt. worden gebruikt om de tumor op te sporen voordat hij echt problemen geeft bij de patient
waarom is mRNA niet altijd voorspellend voor eiwit(activiteit)?
- het kan zijn dat de translatie gereguleerd is
- het kan een regulatie zijn van eiwitstabiliteit (dus het kan zijn dat eiwitten wel worden gemaakt maar ook weer worden afgebroken)
- regulaite van eiwitmodificaties (bv fosforylering)
hoe gebeurt translatie van een mRNA?
ribosoom
hoe worden ribosomen gereguleerd?
systeem van microRNA’s
je hebt ook genen die alleen maar coderen voor RNA
bv microRNA genen. deze hebben ook gewoon een promotor etc en worden afgelezen en gemaakt en dan heb je een pri-microRNA (primair)
pri-miRNA
stukje RNA met een aantal soort van terug in zichzelf vouwingen
regulatie van translatie
je hebt dus pri-miRNA.
1; in de celkern wordt dit geknipt in kortere fragmenten door het Drosha-complex waardoor het daarna pre-miRNA wordt
2; dit pre-miRNA gaat vervolgens naar het cytoplasma
3; daar zit een ander enzym: Dicer
4; Dicer knipt het pre-miRNA naar nog wat kleinere stukjes => mature miRNA
5; hiervan wordt 1 streng ingebouwd in een complex dat het RISC complex heet
6; het RISC complex samen met een miRNA kan binden aan mRNA (mRNA en miRNA zijn complementair en RISC helpt hierbij
7: dit vermindert de translatie van het mRNA door ribosomen of het leidt zelfs tot afbraak van het mRNA
dus even regulatie van translatie samengevat
- miRNA transcriptie
- Drosha knipt het tot pre-miRNA
- transport naar cytoplasma
- dicer knipt het tot miRNA
- 1 streng wordt ingebouwd tot RISC compelx
- miRNA zorgt voor specificiteit, eiwitcomponenten zorgen voor repressie van translatie of mRNA afbraak
dus mRNA en miRNA zeggen samen iets over hoeveel eiwitten er worden getransleerd
door zelf miRNA in cellen te brengen, kan je dat RISC compex forceren en een mRNA naar wens uitzetten
RNA interferentie (RNAi)
- remt mRNA
- heel specifiek
- door het mRNA op verschillende plekken met siRNA’s aan te pakken, zal resistentie niet gemakkelijk ontstaan
