H3.3: Cytogenetische afwijkingen Flashcards
detectie en identificatie van chromosomale afwijkingen
- klassieke cytogenetica (bandering technieken)
- moleculaire cytogenetica
= fluorescente in situ hybridisatie (FISH)
= array (SNP array) - moleculaire diagnostiek
= RQ-PCR (fusie genen)
= Q-PCR
= sequencing (sanger => NGS)
om chromosomen te kunnen typeren moet je … hebben
delende cellen
dus het eerste wat ze doen is het materiaal (beenmerg of bloed (met blasten) …
in kweek brengen
hoe brengen ze materiaal in kweek?
- groeimedium waaraan groeifactoren zijn toegevoegd specifiek voor de cellijn waar de leukemie zich bevindt.
- de kweek duurt 1-2 dagen
1: midden tijdens de mitose stoppen ze de kweek: blijven stilstaan in de metafase.
2: behandeling met hypotone vloeistof zodat de cellen opzwellen
3: behandeling met fixatief zodat het uithardt
4: plaatsen op preparaat glaasjes
verschillende banderingstechnieken
geven allemaal een eigen uniek bandpatroon . elk chromosoom krijgt een eigen specifiek patroon.
in het lab hier gebruiken ze R en Q-bandering omdat deze twee complementair zijn aan elkaar
R en Q-bandering
R: uiteinden goed zichtbaar
Q: uiteinden niet goed zichtbaar
chromosomale afwijkingen
- numerieke afwijkingen
- structurele afwijkingen
numerieke afwijkingen
- winst ( van een compleet chromosoom )
- verlies( van een compleet chromosoom )
structurele afwijkingen
- gebalanceerd: al het DNA is nog steeds aanwezig maar niet op juiste plek of juiste orientatie in chromosoom
- niet-gebalanceerd: verlies/winst deel chromosoom
gebalanceerde structurele afwijkingen
- translocatie
- inversie
- insertie
niet-gebalanceerde structurele afwijkingen
- deletie
- amplificatie
- niet-gebalanceerde translocatie
- gen mutatie
armen van chromosoom
- p-arm: korte arm (petit)
- q-arm: lange arm
centromeer
scheidt de p-arm en de q-arm van de chromosoom
deletie
- terminaal (uiteinde)
- interstitieel (binnenin)
sommige kleine p-armen zijn hetzelfde dus dan maakt translocatie niet uit
translocatie
- reciproke
- robertsomiaanse
inversie
op twee plekken in chromosoom breuk. dat stuk draait 180 graden en gaat dan dus invers verkeerd zitten
- paracentric: within a chromosome arm
- pericentric: round the centromere
complex karyotype
slechte prognose!:
het betekent dat er > 3 chromosoomafwijkingen bij 1 pt in tumorcellen worden gevonden
monosomaal karyotype wat is het?
groep binnen de groep met complex karyotype met een nog slechtere prognose:
- ten minste twee monosomieën (geen X of Y)
- of 1 monosomie gecombineerd met een structurele chromosoomafwijking
monosomaal karyotype
- zeer slechte prognose
- overall survival 4-10% ondanks stamceltransplantatie
nadelen karyotypering
resolutie is erg beperkt.
FISH
- fluorescence in situ hybridization
- je moet vtv weten naar welke regio je wil kijken
FISH mechanisme
1: je kiets voor de regio die je wil onderzoeken een probe
2: probe is gelabeld met fluoriscerend labeltje
3: je brengt probe en DNA van pt bij elkaar. beide moeten tegelijkertijd gedenatureerd (enkelstrengs) worden
4: enkelstrengs DNA probes gaan zoeken naar complementaire DNA streng van pt
5: daar bindt de DNA probe aan
6: dan kan je het signaal dat aan die probe gebonden is met een fluoriscentie microscoop zichtbaar maken
FISH label kleuren
meestal groen en rood
de chromosomen zijn blauw
hoe kan je FISH verschillend toepassen/gebruiken?
- metafase FISH: FISH op gekweekte (delende) cellen (lymfo, leuko, solide tumoren)
- interfase FISH: op kernen van niet delende cellen: snelle analyse, beoordeling op basis van aantal signalen (je gaat tellen hoeveel en adhv kan je kijken of er deleties of mutaties bv zijn en met eventuele probe strategieën translocaties)
waarvoor wordt FISH gebruikt?
- microdeleties
- breukpunten definieren
- cryptische translocaties
- interfase kernen SNELLE DIAGNOSTIEK
beperkingen FISH
- beperkte gevoeligheid
- je krijgt alleen maar antwoorden op de vragen die je stelt
- je kan niet veel targets tegelijkertijd doen
FISH strategie om translocaties op te merken
je kiest probes voor de afzonderlijke genen die betrokken zijn bij de translocatie. in de normale situatie zie je van elke kleur 2. (2 groen, 2 rood). op het moment van translocatie, 1 rode stip, 1 groene stip, 1 gele stip.
FISH break-apart probes
je weet van een gen het breekpunt. je kan prbes kiezen aan weerszijde van dat breekpunt. in normale situatie zie je die dus als geel, omdat het heel dicht bij elkaar ligt. maar als het translocatie is geweest, die je rood, groen en geel. omdat ze verder uit elkaar liggen
multipel myeloom
maligniteit van plasmacellen
chromosomale afwijkingen moeilijk zichtbaar.
oplossing: hoger percentage plasmacellen => zuivering van plasmacellen
zuivering plasmacellen
1: beenmerg wordt gelyseerd
2: rode bloedcellen lyesren en die zijn dan dus weg
3: gebruiken van zuiveringskit met anti-CD138 erin. dit is een marker dat op het membraan van plasmacellen tot expressie komt
4: met soort magneet die marker binden en zo plasmacellen vangen
5: rest van de cellen wegspoelen
6: plasmacellen loshalen van magnetische beats.
anti-CD138
dit is een marker dat op het membraan van plasmacellen tot expressie komt
type afwijkingen belangrijk bij MM
- gebalanceerde translocaties
- deleties
- amplificaties
array heeft goede resolutie
wat bevat array?
heel veel SNP (single nucleotide polymorphism) markers. er zitten op de array heel veel probes en deze zijn allemaal specifiek voor een bepaalde SNP. die probes zijn zo gekozen dat je verwacht dat de meeste van die probes bij mensen een heterozygoot patroon laat zien
SNP
plek in het genoom waarbij je op 1 base positie zowel de ene base als de andere kan hebben zonder dat dat tot klinische consequenties leidt. er zijn 2 allelen, dus met bv A (allel A) en 1 met bv G (allel B). mogelijkheden per individu binnen de populatie:
AA
AB
BB
bij SNP kijken ze naar de B-allel frequentie. dus van alle allelen die aanwezig zijn, welk % is B allel?
normaal = dat je drie lijnen hebt bij B-allel frequentie: bv BB 100%, AB 50% en AA 0%
array
memoraid
array bij deletie
LogR= minder
B-allele frequentie = middenlijn verdwijnt: er is nog maar 1 allel over. het kan A zijn of B, maar geen AA, BB, AB
array bij duplicatie/gain
extra allel dus:
LogR = hoger
B-allele frequentie= middenlijn AB is er dus niet. je hebt wel AAA, BBB, AAB en ABB. dus je hebt 4 lijnen want de middellijn is gesplitst
array normaal
LogR = midden
B-allel frequentie = zowel wat BB, als wat AB, als wat AA
array LOH
LogR = normaal
B-allele frequentie= zonder middellijn. alleen AA en BB.
array bij multipele myeloom
- verlies van hele p-arm chromosoom 2
- winst van q-arm chromosoom 2
- verlies van bepaalde regio van chromosoom 13
- afwijkingen op 17 p
FISH vs SNP array
docu !
reciproke translocatie
Bij een reciproke translocatie wisselen twee niet-homologe chromosomen stukken DNA met elkaar uit. Dit betekent dat een deel van het ene chromosoom naar een ander chromosoom wordt verplaatst, en omgekeerd. Deze uitwisseling is wederzijds (reciprok). Hierdoor kunnen er geen genen verloren gaan, maar wel kan de structuur van de chromosomen veranderen.
robertsoniaanse translocatie
Twee chromosomen “smelten” samen tot één chromosoom, waarbij de korte armen van de chromosomen vaak verloren gaan. Deze korte armen bevatten meestal geen essentiële genen.
