H2.6: Next Generation Sequencing

Question 1

tussen A en T zitten ….. waterstofbruggen

Answer 1

2

Question 2

tussen Cen G zitten ….. waterstofbruggen

Answer 2

3

Question 3

waarom H-brug?

Answer 3

omdat relatief zwak

Question 4

DNA sequencing

Answer 4

het bepalen van de volgorde van de 4 nucleotiden - “basen”- waaruit het DNA molecuul bestaat

Question 5

PCR

Answer 5

polymerase chain reaction
= om DNA zichtbaar te kunnen maken moet er veel meer extra kopieën gemaakt van worden

Question 6

hoe werkt PCR?

Answer 6

1. je hebt dubbel-stranded chromosomaal DNA
2. daar maak je enkelstrengs DNA van dmv denatureren
3. DNA primers herkennen het stukjes dat gesequenced moet worden en binden daaraan
4. nu vindt de PCR plaats, oftewel de DNA synthese
5. en splitst het weer en begint het hele proces opnieuw
6. dit kan zo’n 20-30 keer herhaald worden

Question 7

missense mutation

Answer 7

je codeert voor een ander aminozuur

Question 8

nonsense mutatie

Answer 8

codeert voor stopcodon

Question 9

voorbeelden toepassing DNA-sequencing in de oncologie

Answer 9

• DD
• therapiekeuze
• clonaliteitsanalyse (metastase of 2de primaire tumor?)
• oncogenetica
• weefselidentificatie

Question 10

sanger sequencing

Answer 10

je hebt een mix van je DNA dus met primer en nucleotiden die fluoriscerend gelabeld zijn. dan bouw je die fluoriscerende nucleotiden achter elkaar in op je DNA molecuul. met een laser kan je dit aflezen. op deze manier bepaal je de volgorde. dit kan je dan vergeljken met je referentie.

voorloper next generation sequencing

Question 11

nadeel sanger sequencing

Answer 11

arbeidsintensief en je krijgt maar een heel klein stukje info

Question 12

next generation sequencing

Answer 12

van elk DNA molecuul de volgorde bepalen. maar je kan heel veel DNA moleculen per keer doen en ook van meerdere pt tijdens 1 run.

Question 13

twee verschillende NGS manieren om te sequencen

Answer 13

• amplicon based sequencing
• hybridization enriched sequencing

Question 14

amplicon based seuqncing

Answer 14

met primers sequence je een bepaalt target gebied met PCR.
daar plak je vervolgens bepaalde adapters aan vast. deze zorgen ervor dat je straks nog kan herkennen welk stukje DNA het was. dan is het klaar om te sequencen.

Question 15

hybridization enriched sequencing

Answer 15

je gaat niet eerst PCR doen. je knipt het hele stuk DNA in kleine stukjes, dus niet alleen de target region eruit knippen. dan maak je wel weer de adapters vast. er is een probe dat stukje target region kan herkennen en wordt adhv een heel klein magneetje weggehaald en deze wordt gesequenced.

Question 16

sequence manieren

Answer 16

memoraid!

Question 17

flow cell mechanisme

Answer 17

glasplaat waar al die DNA fragmenten op gaan binden. hierop zijn primers geladen. dus de fragmenten binden met allebei de uiteinden aan de flow cell waardoor er een soort brug vormt. dan vindt een PCR reactie plaats. dit gaat zo door en uiteindelijk heb je clusters van dezelfde fragmenten.
dan worden er gelabelde nucleotiden ingebouwd. dmv een soort foto kan adhv kleur de sequentie worden bepaald.

Question 18

sequencing bij synthesis

Answer 18

memoraid

Question 19

aan die adapters komen ook barcodes die specifiek zijn per patient

Question 20

data verwerking

Answer 20

biochematisch: automatisch: gaat van elk molecuul elk nucleotide langs en legt het naast het normale humane genoom.

Question 21

waarom vindt je bij data verwerking soms bij hetzelfde zowel mutatie als normaal?

Answer 21

je hebt 2 allelen en emestal is een mutatie maar bij 1 allel.
bovendien zit er vaak menging van wel gewoon gezonde cellen bij de tumorcellen.

Question 22

coverage

Answer 22

hoe vaak het is gesequenced. dus ook hoe goed, omdat hoe hoger hoe kleiner de kans dat je een mutatie mist.

Question 23

ref_cov

Answer 23

het wildtype : dus het gewone niet gemuteerde aantal

Question 24

var_cov

Answer 24

hoe veel gemuteerde reads

Question 25

var_freq = VAF

Answer 25

de frequentie van een bepaalde mutatie

Question 26

VAF formule

Answer 26

VAF = var_cov / coverage * 100% = ….%

Question 27

er wordt geprobeerd altijd minimaal 20% tumor cellen te sequencen (dus 20% tumor in de DNA mix)

Question 28

als je een KRAS mutatie in 46% terug vindt, wat is dan de tumor cel percentage?

Answer 28

92%. je doet het mutatie percentage keer 2 en dan weet je je tumorcel percentage

Question 29

VAF: variant allel frequentie

Answer 29

hoe vaak een variant op een specifieke positie voorkomt tov de referentie sequentie

Question 30

waarvan is VAF afhankelijk?

Answer 30

• gen (oncogen (dominant) vs tumor-suppresor gen (recessief)) dus heeft ermee te maken hoeveel gemuteerde allelen je nodig hebt voordat het kanker is
• tumorcelpercentage

Question 31

coverage (deep sequencing)

Answer 31

aantal malen dat een base-positie (onafhankelijk) bepaald is.
hoe hoger, hoe “deeper” (beter) gesequenced

Question 32

WES: whole exome sequencing

Answer 32

sequencen van alle exonen van alle genen

Question 33

WGS: whole genome sequencing

Answer 33

sequencen van totale genoom

Question 34

ngs overzicht

Answer 34

• single molecule
• duizenden fragmenten/analyse
• output 1-20 x 10^9 basen
• weinig DNA nodig
• hoge gevoeligheid
• poolen van samples (barcode)
• bio-informatica vereist

Question 35

sanger sequencing overzicht

Answer 35

• mix van moleculen
• 1 fragment/analyse
• output pax 1000 basen
• veel DNA nodig
• lage gevoeligheid
• poolen niet mogelijk
• eenvoudige analyse