VL 3: Postina: Viraler Gentransfer

Question 1

Welche Vor- und Nachteile bringt der virale Transfer?

Answer 1

Vorteile:
‐Sehr effiziente Infektion (nahezu 100%)
‐hohe Kopienzahl
‐teilweise Integration in das Genom
Nachteile:
-Sicherheitsaspekte
‐teilweise Integration in das Genom

Question 2

Was sind Adenoviren?
Wie groß ist deren Genom ungefähr?
Wie viele Subtypen gibt es?

Answer 2

DNA-Viren, die eine lineare Doppelstrang-DNA (dsDNA) mit einer Größe von ca. 26-45 kbp besitzen.
Es gibt ca 50 Subtypen.

Question 3

Wie sind Adenoviren aufgebaut?
Wie groß sind sie ungefähr?
Empfindlich gegenüber?

Answer 3

• Das Genom befindet sich in einem ikosaedrisches Kapsid aus 252 Capsomeren.
• Größe von ca. 70 bis 90 nm.
• Proteinhülle die ds DNA umfasst und bestimmte Proteine zur Vermehrung des Virus.
  -> relativ resistent gegenüber Umwelteinflüssen und Detergenzien,
  -> empfindlich gegenüber mäßigem Erhitzen (60 °C.)

Question 4

Symptome von Adenoviren?

Answer 4

Klinische Symptome:
* leichte bis schwere Atemwegsinfektionen
* Infektionen
* Virus infiziert ruhende und sich teilende Zellen.

Question 5

Welcher wichtige Sicherheitsaspekt ist beim Arbeiten mit Adenoviren zu beachten?

Answer 5

Integriert NICHT in das Genom der infizierten Zelle

Question 6

Die Adenoviren verfügen über sogenannte Early Genes (E1 bis E4).
Welche Funktionen haben sie?

Answer 6

E1: Regulation der Transkription viraler DNA
E2: Kodiert für Proteine der DNA-Replikation
E3: Modulation der Immunantwort des Wirts und Steuerung der Virenfreisetzung
E4: Regulation von Transkription, mRNA- Transport und DNA-Replikation

Question 7

Das Genom von Adenoviren besitzt neben Early Genes noch andere wichtige Genabschnitte.
-> Was machen die Late Genes (L1-L5)?
-> Was sind ITRs?
-> Was macht das Verpackungssignal?

Answer 7

Late Genes sind für die Expression der Virus-Strukturproteine für das Capsid zuständig.
ITRS: Inverted Terminal Repeats- sind wichtig für DNA Replikation.
Verpackungssignal: Verpackt Virus-DNA in Capsid.

Question 8

Adenovirale Vektoren wurden bei der Entwicklung von Sars-CoV-2-Impfstoffen verwendet.
-> Wofür wurden sie eingesetzt?
-> Welche Strategien wurden verfolgt?

Answer 8

Die Impfstoffe codieren für das Spike-Oberflächenprotein.
* BioNtech und Moderna Impfstoffe nutzen modifizierte mRNA.
* AstraZeneca,Sputnik und Johnson & Johnson nutzen rekombinierte adenovirale Vektoren, die die Gene für das Protein tragen.

https://www.gelbe-liste.de/coronavirus/corona-impfstoffe-vergleich#Impfstofftyp

Question 9

Mit rekombinierten Viren können Zellen infiziert werden.
-> Wie spezifisch ist das Adenovirus und woran bindet es?
-> Allgemeine Vor- und Nachteile bei der Impfstoffentwicklung?

Answer 9

Das Adenovirus ist nicht zellspezifisch (aber speziespezifisch), und bindet an Bindungsrezeptoren wie Integrine und CAR, die ubiquitär vorkommen.
VORTEIL: starke transiente Expression des Fremdgens
NACHTEIL: hohe Immunogenität der viralen Proteine

https://www.gelbe-liste.de/coronavirus/corona-impfstoffe-vergleich#Impfstofftyp

Question 10

Wie stellt man Adenovirale Vektoren her?

Answer 10

• Ersetze dein E1 Bereich durch Fremd-DNA ( bis zu 8 kbp zu ersetzbar)
  -> muss Promotor und Poly-A-codierende Sequenz enthalten
• Deletion der E3 Region -> Virus ist weniger immunstimulativ
• Nutze rekombinante Zelllinie, die die Genome zur Proteinherstellung enthält, die beim Virus durch E1 Deletion fehlen

Question 11

Was ist der cytopathogene Effekt?

Answer 11

cytopathogenen Effekt:
Durch die Vermehrung von Viren hervorgerufene degenerative Veränderungen der infizierten Zellen:
Bildung von Riesenzellen, Syncytien, Einschlußkörpern, Vakuolen und Granula, Veränderungen des Zellkerns, Lyse der Zellen.

Question 12

Was passiert mit der Proteinbiosynthese der Wirtszelle nach einer Infektion?
Welchen Einfluss hat das auf Tumorsupressorgene?

Answer 12

• Die Infektion mit Adenoviren führt in der Wirtszelle zur Abschaltung der zellulären DNA-, RNA- und Proteinsynthese.
• In Zellkulturen kommt es zu einem charakteristischen cytopathogenen Effekt..
• Zelluläre Tumorsuppressorproteine wie pRB p53 verlieren regulatorische Funktion als Inhibitor der Zellteilung.

Question 13

Welcher Trick wird verwendet um eine leichte Vervielfältigung des Adenovirusgenoms zu ermöglichen?

Answer 13

Überführe das Adenovirusgenom in Plasmide, zB über homologe Rekombination.
Ein Plasmid (pAdEasy-1) besitzt die Viren des Adenovirus, das andere die zu exprimiernden Fremdgene (GOI-Gene of intrest).
Im nächsten Schritt werden Plasmide über bestimmtes Restriktionenzyme geschnitten und über homologe Rekombination erhält man den geklonten Plasmidvektor. Dieser wird linearisiert (Aufschneiden) und dann in Zellen tranfeziert.

Question 14

Was sind Retroviren?
-> Wie groß sind sie?
-> Wodurch zeichnen sie sich aus?

Answer 14

umhüllte meist sehr wirtsspezifische Viren mit ss-RNA Genom (2 Kopien im Capsid)
Genomgröße: 7-15kbp

• ss RNA als Erbinformation
• Enzyme reverse Transkriptase und Integrase.

Question 15

Welche Vor-und Nachteile hat es Retrovirale Vektoren einzusetzen?
-> Beispiel für ein Retrovirus?

Answer 15

Vorteile:stabile Transformation des Wirtsgenom
Nachteil: potentiell onkogene Wirkung

Bsp. HI-Virus

Question 16

Was ist das besondere der Reversen Transkriptase der Retroviren?

Answer 16

Reverse Transkriptase ist eine RNA-abhängige Polymerase und hat eine RNAse-Aktivität!.
->Synthetisiert sie mit Hilfe mitgebrachter tRNA-Primer einen RNA-DNA-Hybrid
-> Baut dann mit Hilfe ihrer RNAse-H-Aktivität den RNA-Anteil des Hybrids ab.

Question 17

Wie vermehren sich Retroviren?

Answer 17

1. Infektion
   2.Reverse Transkriptase synthetisiert sie mit Hilfe mitgebrachter tRNA-Primer einen RNA-DNA-Hybrid und baut dann mit Hilfe ihrer RNAse-H-Aktivität den RNA-Anteil des Hybrids ab.
2. Komplementärer zweiter DNA-Strang wird mittels DNA-abhängiger-DNA-Polymerase-Aktivität aufgebaut
3. . Virale Integrase, welche Ligase- und Endonuklease-Aktivität zeigt, an die Enden der cDNA, um das Virusgenom als Provirus in das Wirtsgenom zu integrieren.
4. Virale Proteine, Capsid-Proteine und auch die virale RNA werden produziert.
5. Nach Verpackung knospet der Viruspartikel aus. Ein Teil der Zellmembran dient dem Virus als neue Hülle.

Question 18

Welche Zellen befallen Retroviren?
-> Was passiert mit dem Provirus im Wirtsgenom?

Answer 18

• Das auf dem Viruspartikel vorhandene Glykoprotein gp120 sorgt dafür, dass nur Zellen, die mit dem CD4-Antigen ausgestattet sind, befallen werden.
• Der Provirus bleibt im Wirtsgenom vorhanden, um dort weiter transkribiert und bei der Zellteilung an die Tochterzelle weitergegeben zu werden.

Question 19

Was sind die Grundelemente replikationsfähiger proviraler DNA?

Answer 19

• gag (für gruppenspezifische Antigene) codiert für Capsidproteine
• env codiert für Proteine der Virus Hülle (für Glykoproteine)
• pol codiert für die Enzyme reverse Transkriptase,Protease und Intergase
• LTR: long terminal repeats: wichtig für Integration in das Genom, enthalten regulatorische Sequenzen (Promoter, Enhancer)
• Verpackungssignal

Question 20

Wieviel % des humanen Genoms ist retrovirale DNA?

Answer 20

9 %
5mal mehr als Protein-codierende Sequenzen.

Question 21

Wie wird die virale RNA in das Genom integriert?

Answer 21

1. Virale ss RNA wird durch Reverse Transkriptase zu ds DNA (länger und gfrößer als RNA)
   -> Enden der ssRNA dienen als Matrizen für DNA Synthese auf gegenüberliegender Seite -> LTRs werden erzeugt.
2. dsDNA wird ins Genom der Zielzelle integriert. LTRs enthalten Promotor und Enhancer.
   -> “Linker LTR” mit U3-R-U5 ist der Promotor der RNA-Polymerase.
3. Transkription -> Erhalte virale RNA, die für Virusproteine codiert.
4. Verpackung

Question 22

Was genau passiert bei reversen Transkription?

siehe das unten stehende Youtube Video

https://www.youtube.com/watch?v=RYwVnzYf4V8

Answer 22

1. tRNA bindet an der primer binding site (pbs) nahe am 5´ Ende der viralen mRNA.
2. R-U5 (das ist der 3´-Ende der tRNA) fungiert als Primer. Auf der viralen mRNA des Virus befinden sich viele u5-Sequenzen(Repeats). Am 3’-Ende der der mRNA sitzt die Einheit r-u3. Bei der reversen Transkription wird r-u5 am 5´-Ende gebildet.
3. Wenn das Virus die Zelle infiziert hat, nutzt die Reverse Transkriptase R-U5 von der tRNA als primer und produziert cDNA, in Richtung des 5´-Endes des Strangs,(dh. es entsteht eine relativ kurze cDNA).
4. Dieses kurze Stück cDNA((-) strong-stop DNA) wird mit dem anderen Strang mit r-u3 hybridisieren (Annealing). r-u5 (=Die zur cDNA komplementäre mRNA Sequenz am 5’- Ende) wird abgebaut.
5. Reverse Trankskriptase setzt die Synthese von cDNA fort, die entsprechende RNA-Sequenz des Hybridstrangs wird abgebaut. Die pbs wird duplikiert. Dabei wird ppt (polypurine tract der mRNA) nicht verdaut. PPT dient als Primer für den zweiten DNA-Strang, der zeitgleich jetzt von der Reversen Transkriptase gebildet wird.
6. Die tRNA wird abgetrennt und diffundiert ab, wenn ein Teil des zweiten Strangs hergestellt wurde. Beide Stränge verfügen über pbs, die komplemtär zueinander sind und aneinander binden. (Der zweite Strang wird als (+)strong-stop DNA bezeichnet)
7. Der Zweite Strang wird komplett fertiggestellt, wir erhalten eine lineare doppelsträngige DNA: An den den Enden befindet sich jeweils die U3-R-U5 Einheit,die auch als LTR (Long terminal repeats) bezeichnet werden.

Ausführliche Erklärung: beistehendes Video 28:00-34:00

https://www.youtube.com/watch?v=kaMdXiqoPlc

Question 23

Was ist ein SIN Vektor?

Answer 23

SIN (self inactivating) Vektor : DNA-Konstrukt zur Erzeugung eines rekombinanten Retrovirus, mit Deletion einer U3 Stelle.

Question 24

Wie stellt man einen SIN-Vektor her?

Answer 24

.Herstellung SIN:
Entferne viral codierte Sequenz und ersetze sie durch GOI.
->GOI hat einen extra Promoter für die Expression.
->An der U3-Region einer Seite wurde ein Teil deletiert

->Er halte ein schwaches LTR, mit nur schwacher Promoterfunktion.

Question 25

Wie stellt man Retroviren her, die sich selbst inaktivieren?

Answer 25

1.Herstellung SIN- Vektor
2. Nach Transfektion wird die DNA von der Helferzelle aufgenommen und ins Genom integriert.
3. Erhalte nach Transkription mit Helferzelle virale RNA.
-> Dem Virus fehlen bestimmte Verpackungsgene (wurden deletiert und dafür GoI eingesetzt), weswegen die Helferzellen vorher so modifiziert werden müssen. um diese Komponenten bereit zu stellen.
4. Rekombinates Virus wird verpackt und kann die Zielzelle infizieren und wird in das Genom der Zielzelle integriert. Die rechte (schwache) LTR Region wird auf die andere Seite übertragen. Erhalte nach reverserser Transkiption auf beiden Seiten schwache LTR.

-> Wirtsgene werden schlechter beeinflusst und das Virus ist sicherer. GoI konnte mit Hilfe des Extra-Promoter exprimiert werden.

Question 26

Welche weitere Absicherungsmöglichkeit gibt es, wenn man Gentransfer mit retroviral Vektoren macht?
Was ist ein Bespiel für einen solchen Vektor?

Answer 26

Modifizierung der SIN-Vektoren durch Mutation der pbs:
* Dadurch können endogene tRNAs nicht mehr als Primer fungieren, und ein anderer hergestellter tRNA-Primer, der zB über Plasmid codiert, muss zur Verfügung gestellt werden.
* Das HIV-basierende Delievery-System, das ohne Helferzellen auskommt.