VL 3 Postina: Nucleinsäuren Flashcards
Was ist Gentransfer?
Das Einbringen von RNA oder DNA in Zellen oder in das Genom von Zellen.
Welche Ziele verfolgt man mit dem Einbringen von siRNA und mRNA?
siRNA: selektive Unterdrückung der Expression eines Gens
mRNA:Proteinexpression (Impfstoff, Krebs‐Immuntherapie, tumorspezifische Antigene)
In der Forschung wird DNA in Zellen eingebracht um mit ganzen Genen (Promotor, Exons, Introns, regulat. Sequenzen) zu arbeiten.
-> Was kann man mit cDNA machen?
-> Wofür führt man Gene ein?
cDNA: doppelsträngiges DNA‐Analogon der einzelsträngigen mRNA
‐Editierung von Genomen (knock out, knock in, Mutagenese)
-Erstellung genomischer Bibliotheken (bilden ein gesamten Genoms in vielen Teilen ab, Humanes Genomprojekt…..)
‐Untersuchung der Genregulation, Epigenetik
Die Klonierung größerer DNA-Fragmente ist durch die Kapazität der Vektoren beschränkt.
-> Wie groß ist Kapaziät von Plasmiden?
-> Was ist der Grund für das Limitierung?
- Plasmide: 6kbp
- Sonst keine stabile Ringbildung
Die Klonierung größerer DNA-Fragmente ist durch die Kapazität der Vektoren beschränkt.
-> Wie groß ist Kapaziät von Phagen?
-> Was ist der Grund für das Limitierung?
- Phagen: 5-25 kbp
- Sonst keine Verpackung in den Phagenköpfen
Die Klonierung größerer DNA-Fragmente ist durch die Kapazität der Vektoren beschränkt.
-> Wie groß ist Kapaziät von Cosmiden?
-> Was ist der Grund für das Limitierung?
- Cosmiden: 35-45 kbp
- Sonst keine Verpackung in den Phagenköpfen
Die Klonierung größerer DNA-Fragmente ist durch die Kapazität der Vektoren beschränkt.
-> Wie groß ist Kapaziät von P1-Phagen?
-> Was ist der Grund für das Limitierung?
- P1-Phagen: 70-100 kbp
- Sonst keine Verpackung in den Phagenköpfen
Die Klonierung größerer DNA-Fragmente ist durch die Kapazität der Vektoren beschränkt.
-> Was sind BACs?
-> Wie groß ist Kapaziät von BACs?
-> Was ist der Grund für das Limitierung?
- Bacmide: (Bacterial artificial chromosome): Abkömmlinge des F‐Plasmids
- BACs:
<300 kbp - Sonst instabil
Die Klonierung größerer DNA-Fragmente ist durch die Kapazität der Vektoren beschränkt.
-> Was sind YACs?
-> Wie groß ist Kapaziät von YACs?
-> Was ist der Grund für das Limitierung?
- YAC Plasmide (YAC: Yeast artificial chromosome)
- YACs: 200 - 2000 kbp
- Sonst instabil
Die Klonierung größerer DNA-Fragmente ist durch die Kapazität der Vektoren beschränkt.
-> Welche Vektortypen gibt es?
Es gibt verschiedene Möglichkeiten Nucleinsäure zu transferieren. Die Methoden variieren in ihrer Effizienz (dem Verhältnis von transienten Einbau oder permanenten Klonieren).
Nenne 4 gängige Methoden.
Gängige Methoden sind :
* Mikroinjektion in die Zelle
* Elektroporation
* Virusinfektion
* und Transfektion
Welche Methoden zur Transfektion gibt es (3)?
Transfektion mit:
a.)CaPO4
b) DEAE-Dextran (Diethylaminoethyl-Dextran= positiv geladene, stark verzweigten Polymere die Plasmid-DNA komplexieren)
c) Liposomen
Was ist das Prinzip chemischer Transfektion?
- Komplexierung von Nukleinsäuren mit einem Trägermaterial, das bereitwillig von Zellen aufgenommen wird.
-> Nukleinsäure wird von positiven Ladungen des Transfektionsreagenz elektrostatisch gebunden. - Zelloberfläche hat überwiegend mit negativen Ladungen.
->Transfektionsreagenz mindert die Abstoßung der negativ geladenen Nukleinsäure und der überwiegend negativ geladenen Zelloberfläche.
Was ist Elektroporation?
-> Beispiele von Permablisierung?
- Durch ein elektrisches Feld wird die Zellmembran temporär permeabilisiert.
Bespiele
* Konformation von Membranbestandteilen wird verändert.
* Abschnüren von Membranbereichen zu Vesikeln
* Intrazellulären Bestandteilen werden freigesetzt, induziert durch hydrostatische Druckunterschiede und osmotische Effekte.
Was sind Vor- und Nachteile der Elektroporation?
Vorteile:
* Die Elektroporation ist mit allen Zelltypen möglich.
* Die Transformationsrate von Bakterien ist bei dieser Methode höher als bei den chemischen Transformationsverfahren.
Nachteile:
* Nicht alle Poren schließen wieder
-> Zellviabilität sinkt, ggf bis zum Zelltod. .
Was versteht man unter Lipofektion?
Durch eine Lipofektion werden Nukleinsäuren (z. B. ein Vektor) durch Bindung an oder Einschluss in Liposomen in Zellen eingeschleust. Die Liposomen fusionieren nach Endocytose mit der Endosomenmembran.
Was versteht man unter Lipofektion? Wofür könnte DOTAP (siehe Abbildung) gebraucht werden?
Wo wird das heute häufig angewendet?
- Bei Liposomen, Vesikeln oder Micellen mit kationischen Lipiden kann eine Komplexierung mit den anionischen Nukleinsäuren erfolgen, bei ungeladenen Lipiden und Membranlipiden müssen die Nukleinsäuren durch eine Einschlussimmobilisierung in Liposomen oder Vesikeln eingeschlossen werden.
- Die Einschlussimmobilisierung in Liposomen bzw. deren Herstellung erfordert einen höheren zeitlichen Aufwand als die Adsorption, kann jedoch auch Flüssigkeiten und somit auch Moleküle mit einer weniger negativ geladenen Oberfläche in Zellen einschleusen.
Aktuelle Anwendungen: Formulierung der mRNA‐basierten Sars‐CoV‐2 Vakzine
Moderna (mRNA‐1273):
Nukleosidmodifizierte mRNA eingebettet in SM‐102‐Lipid‐Nanopartikel
BioNtech (BNT162b2):
Modifizierte mRNA, eingebettet in Lipid‐Nanopartikel.
Herkunft von Nucleinsäuren
Von wo wird DNA idR isoliert?
- DNA wird normalerweise als Plasmid-DNA aus Bakterien (E.Coli) isoliert.
mRNA wird idR durch in vitro Transkription an Plasmid-DNA erhalten.
Wie läuft die in-Vitro Transkription ab?
- Plasmid-DNA wird linearisiert hinter der für Poly-A-Schwanz- codierenden Sequenz.
- Vor der Sequenz sitzt der Promoter der T7-RNA-Polymerase. Die Sequenz enthält ein Startcodon und Stopcodon, sowie die Kozak-Sequenz welche später für die Bindung an Ribosomen benötigt wird.
- Transkription startet durch T7-RNA-Polymerase
- Der Strang muss noch am 5´-Ende geschützt werden: Durch Vaccinia virus Capping Enzyme(VCE)+GTP + SAM erhält man eine 5´-G-Cap an der mRNA.
https://www.youtube.com/watch?v=3tI2QdXZxxU
Wozu braucht man 5´-Cap bei der Transkription?
Die 5′-Kappe schützt nicht nur eine RNA vor Abbau, sondern ist des Weiteren auch für den Export einer mRNA aus dem Kern in das Zytoplasma wichtig sowie für die Translation der mRNA durch Ribosomen.
https://www.youtube.com/watch?v=3tI2QdXZxxU
Herstellung mRNA-basierter Corona-Impfstoffe:
-> Worin unterscheidet sich die RNA?
-> Was für Vorteile bringt das?
die mRNA enthält modifiziere Nukleoside wie :
Pseudo-Uridin, 5-Methyl-Uridin, 2-Thio-Uridin, 6-Methyl-Adenosin, 5-Methyl-Cytosin
Vorteile: mRNA ist stabiler und indusizert weniger unspezifische Immunantworten
