VL 3 Postina: Phagen und Cosmide Flashcards
Was sind Bakteriophagen?
-> Einteilung?
Als Bakteriophagen bezeichnet man verschiedene Gruppen von Viren, die auf Bakterien als Wirtszellen spezialisiert sind.
Bakteriophagen werden taxonomisch nach ihrem Genom-Aufbau, ihrer Morphologie und ihrem Wirt eingeteilt.
Man unterscheidet zwischen ssDNA-Phagen und dsDNA-Phagen.
Wie sind Phagen aufgebaut?
T-Phagen zeichnen sich gegenüber sonstigen Bakteriophagen durch einen relativ komplexen Aufbau mit „Kopf-Schwanz-Struktur“ aus:
* Grundplatte mit einem Einspritzapparat (Injektionsapparat oder Schwanz),
* Die Grundplatte ist mit Schwanzfibern und Spikes besetzt, die der Adsorption auf der Wirtszellwand dienen.
* Kopf, bestehend aus dem so genannten Kapsid und der darin enthaltenen DNA, zusammen .
Wie groß ist Lambda Phagen DNA?
-> Wie sehen die DNA Enden aus?
Die λ-Phagen-DNA ist doppelsträngig und hat eine Länge von 48 kbp.
Die DNA besitzt überhängende, einzelsträngige Enden (cos-sites), die 12 Basen lang sind und die die Zirkularisierung des DNA-Genoms gestatten.
https://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/5/bc/vlus/viren.vlu/Page/vsc/de/ch/5/bc/viren/bsp_vertreter/lambda/genom.vscml.html
Wie ist das Genom von Lambda Phagen lokalisiert?
Lineares Genom im Phagenkopf,
zirkuläres Genom im Bakterium
https://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/5/bc/vlus/viren.vlu/Page/vsc/de/ch/5/bc/viren/bsp_vertreter/lambda/genom.vscml.html
Nach Zirkularisierung der DNA kann die Bakteriophage Lambda in das E.coli Genom integreiert werden.
Dies ist ein seltener Vorgang. Wie ist die Integration möglich?
über att-Stellen ( =homologe Sequenzbereiche)
https://www-ncbi-nlm-nih-gov.translate.goog/pmc/articles/PMC1994661/?_x_tr_sl=de&_x_tr_tl=en&_x_tr_hl=de&_x_tr_pto=wapp
Nach Zirkularisierung der DNA kann die Bakteriophage Lambda in das E.coli Genom integriert werden.
Dies ist ein seltener Vorgang.
Wie funktioniert die Integration über att-Stellen?
- Benötige Phagen-codiertes Protein int.
-> Ortsspezifische Rekombination zwischen der Phagen- Att -Stelle POP’(=attP) und der primären Bakterien - Att -Stelle BOB’ (=attB). - Erhalte Prophagen, der durch eine linke Prophagen - att -Stelle, BOP’ ( att L), und eine rechte Prophagen - att -Stelle, POB’ ( att R.), begrenzt ist.
https://www-ncbi-nlm-nih-gov.translate.goog/pmc/articles/PMC1994661/?_x_tr_sl=de&_x_tr_tl=en&_x_tr_hl=de&_x_tr_pto=wapp
Nach Zirkularisierung der DNA kann die Bakteriophage Lambda in das E.coli Genom integreiert werden.
Dies ist ein seltener Vorgang.
Wie funktioniert die Excision über att-Stellen?
- Benötige die Proteine int und xis
-> Rekombination zwischen attL und attR - Erhalte attB und attP (ausgeschnittener Phage)
https://www-ncbi-nlm-nih-gov.translate.goog/pmc/articles/PMC1994661/?_x_tr_sl=de&_x_tr_tl=en&_x_tr_hl=de&_x_tr_pto=wapp
Amplifizierung der Phagen DNA
Wenn die Phage des Bakterium gefallen hat, läuft die Vermehrung und Ausbreitung des Virus hauptsächlich über den Lytischen Weg.
Was genau passiert?
- Bakteriophagen binden mit ihren Spikes an die Wirtszelle. Injektion der Phagen-DNA. Eine leere Phagenhülle bleibt an der Außenseite der Zelle zurück.
- Phagen-DNA zirkuliert. Transkription und Translation der viralen Gene.
- Enzyme entstehen, die das bakterielle Chromosom zerstören.
- Die Phagen-DNA übernimmt die Kontrolle über die Zelle . Umstellung des Stoffwechsels auf die Produktion von Phagenkomponenten.
- Die Komponenten werden intrazellulär zu neuen infektiösen Phagen zusammengesetzt.
- Durch Phagen-DNA stellt die Zelle das Enzym Lysozym her, das die Bakterienzellwand auflöst
-> Zelle nimmt osmotisch Wasser auf, schwillt an und “platzt”.
->Freisetzung von etwa 100 bis 200 neuer Phagen .
Amplifizierung der Phagen DNA
Seltener verläuft die Vermehrung und Ausbreitung des Virus über den Lysogenen Weg.
Was genau passiert?
- Bakteriophagen binden mit ihren Spikes an die Wirtszelle. Injektion der Phagen-DNA. Eine leere Phagenhülle bleibt an der Außenseite der Zelle zurück
- Das Phagen-Genom wird an einer spezifischen Stelle in das Chromosom der Wirtszelle eingebaut (Prophage) und codiert ein Repressorprotein, das die meisten Prophagengene unterdrückt.
- Bei jeder der anschließend folgenden Zellteilungen wird die Phagen-DNA zusammen mit Wirts-DNA repliziert.
->Entstehung großer infizierten Bakterienpopulation
->Die Wirtszellen werden dabei nicht vernichtet. - Spontan oder durch äußere Einflüsse bedingt kann die Phagen-DNA aus dem Chromosom herausgeschnitten werden und ein lytischer Zyklus beginnt, der dann den Zelltod zur Folge hat.
Was muss beachtet werden wenn man Phagen als Genfähre nutzen will?
-> Welche Gene sind entbehrlich und können durch Fremd-DNA ersetzt werden?
Gene für lytischen Weg müssen erhalten bleiben.
Gene für lysogenen Weg sind entbehrlich.
Wie groß ist der Bereich des Lambda-Genom der durch Fremd-DNA ersetzt werden kann?
-> Wo wird sich die DNA befinden?
-> Was limitiert die Größe beim Einbau von Fremd-DNA?
Bis zu 24,6 kbp sind ersetzbar, Fremd-DNA wird in Phagenköpfe eingebaut.
Eine Genomgröße von 51 kbp kann noch in den Lambda-Phagen verpackt werden , wegen der Größe der Phagenköpfe..
Was ist die Mindestgröße um einen noch lebensfähigen Phagen zu generieren und was muss unbedingt erhalten bleiben?
Die Mindestgröße eines verpackbaren Genoms ist : 38 kbp.
Die Anwesenheit der cos‐Stellen ist für die Verpackung und Zyklisierung essentiell.
Wie werden Lambda-Phagenvektoren erzeugt?
- singuläre Restriktionsschnittstellen benötigt
- Deletion endogener Schnittstellen durch Deletion oder Mutagenese
- Einbringung eines Selektionsmarkergens (z.B. Lac Z, Blau/Weiß‐Selektion)
.
Was ist eine cDNA-Bank?
Eine cDNA-Bank spiegelt die Gesamtheit der zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle vorhandenen mRNAs wider. Je häufiger ein bestimmtes Gen abgelesen und in mRNA übersetzt wurde, desto häufiger ist diese cDNA auch später in der cDNA-Bank vertreten.
Eine cDNA-Bank ist eine doppelsträngige DNA-Kopie von mRNAs.
http://www.chemgapedia.de/vsengine/tra/vsc/de/ch/5/bc/vlus/gentechnik/methoden.tra/Vlu/vsc/de/ch/16/biochem/pcr/pcr_del/deletion.vlu/Page/vsc/de/ch/16/biochem/pcr/pcr_anwendung/cdna_bank.vscml.html
Wie isoliert man einzelsträngige mRNA?
Reife mRNA trägt in Eukaryoten einen Poly-A-Schwanz.
-> Diese Poly(A)-mRNAs lassen sich leicht isolieren, indem man Affinitätssäulen mit oligo-dT einsetzt, an die Poly(A)-mRNA bindet.
Wie stellt man an eine Expressionsbibliothek (cDNA-Bank) her?
- Isolierung der mRNA.
- mRNA wird mit Hilfe eines oligo-dT-Primers und der Reversen Transkriptase in ein RNA-DNA-Hybrid überführt. (DNA-Erststrang-Synthese)
- Synthese des zweiten DNA-Strangs: Mit RNase H werden Einzelstrangbrüche in den RNA-Strang gemacht. Diese RNA-Reste dienen als Primer für DNA-Zweitstrang.
-> Erhalte mit dNTPs und DNA-Polymrase eine doppelsträngige DNA. - Mit Nuclease (Mung Bean-Nuclease) werden heterogene Enden der DNA die unterschiedlich lang sind, zu Enden sie gleich lang sind (glatte Enden).
- Damit bestimmte interne Schnittstellen vom Restriktionsenzym nicht erkannt werden , werden sie methyliert (Hier mit Eco-R1-Methylase).
- Baue mit DNA-Ligase Adaptormoleküle (synthetisches ds DNA-Molekül mit ECoRI-Erkennungssequenzen) an die Enden.
- Schneiden mit EcoRI.-> cDNA-Fragmente mit Eco-RI komplimentäre Überhänge.
- Einbau in Phagen-DNA, welche EcoRI Schnittstelle hat.
.
Wie wird Bakterienphagen -DNA (auch rekombinante) verpackt?
- Verpacken erfolgt automatisch, wenn alle Proteine, die für Phagenhülle notwendig sind, vorhanden sind
- Brauche für die Verpackung cos-Enden beidseitig
-> Lysate mit Phagen-Hüllproteine auch käuflich erhältlich
Das Cosmid trägt einen E. coli-Replikationsursprung (ori), mit dessen Hilfe sich das Cosmid als Plasmid in E.coli vermehren kann. Daneben trägt das Cosmid zwei cos-Stellen, die eine singuläre ScaI-Schnittsequenz flankieren.
Wie wird mit Cosmiden kloniert?
- Über die singuläre Schnittstelle einer Restriktionsendonuclease, in diesem Falle Bam HI, wird das Cosmid und die zu klonierende DNA geschnitten.
- Ligation der Fremd-DNA-Fragmente mit DNA-Ligase
->Fremd-DNA-Fragmentgröße ist ca. 40 kb, da der Abstand der beiden cos-Stellen zueinander ca. 50 kb betragen muss, um stabil in die Phagenköpfe verpackt zu werden.
