VL 1 Gimpl: Gen-Editing Flashcards
Spiralisierung
In der Gentechnik spielt die Restriktionsanalyse eine bedeutende Rolle, zum Beispiel zum Überprüfen ob die Klonierung von Plasmiden erfolgreich war. Ein Problem, was bei der Auswertung der Gel-Elektrophorese auftreten kann, ist dass DNA spiralisiert.
Wie kommen die unterschiedlichen Banden im Gel zustande? Wie liegt die DNA in der jeweiligen Bande vor?
Welche Methode verwendet man um die Lokalisierung bestimmter DNA-Sequenzen nachzuweisen? (Name)
FISH, Fluoreszens-in situ-Hybridisierung
DNA-Nachweis in Zellen
Wie funktioniert FISH?
https://www.youtube.com/watch?v=LiRJoTi44TA
1. Fixiere die Zelle auf Glasträger mit Formaldehyd (bewirkt Protein-Protein- und Protein-Nukleinsäuren-Crosslinks)
2. Probendesign:
Proben müssen komplementär zur Chromosomenregion sein, die untersucht werden soll.
Verwende kurze ds DNA oder ds RNA- Proben und erzeuge mit DNAse nicks. Mit speziellen modifizierten Nucleotiden, die fluoreszenzmarkiert sind, werden durch die Nicks durch die Ligase verschlossen. Amplifiziere die Probe durch PCR.
3. Denaturierung der Probe und der Target-DNA durch z.B. Hitze (95°C).
4. Hybridisierung von Probe und Target-DNA (Abkühlen), ungebundene Proben-DNA durch Waschen entfernen.
5. Analyse durch Fluoreszenz-Mikroskopie, nur Signal wenn die Probe komplementär zur Target-DNA ist.
Wofür braucht man bei FISH Propidiumiodid?
-> Welche Farbe hat es?
Das Propidiumiodid (PI) ist eine häufig verwendete, rot fluoreszierende nukleäre und Chromosom-Gegenfärbung.
Da Propidiumiodid lebende Zellen nicht durchdringt, wird es auch häufig verwendet, um tote Zellen in einer Population zu erkennen.
Morbus Huntington
Der Morbus Huntington ist eine erbliche, degenerative Funktionsstörung des Gehirns.
Ein anderer Name für Morbus Huntington ist Chorea Huntington.
Woher rührt dieser Name?
Ursache?
- Chorea Huntington geht vom griechischen Wort “chorea” = Tanz aus und bezieht sich auf die charakteristischen Bewegungsstörungen, die Teil der Krankheit sind.
- 1993 haben Wissenschaftler das Gen, das die Huntington Krankheit verursacht, identifiziert.
- Bei Betroffenen des Morbus Huntington gibt es zu viele Gene der Sequenz CAG auf dem Chromosom 4. Dadurch ist die Proteinsynthese gestört.
Wie konnte man bei Morbus Huntington nachweisen, dass es zu viele Gene der Sequenz CAG auf dem Chromosom 4 gibt? (Dadurch ist die Proteinsynthese gestört.)
FISH
Entstehtung repetitiver DNA-Sequenzen
Hochrepetitive DNA-Sequenzen entstanden evolutionär aus Genduplikationen und Mutationen. Gen 1 und Gen 2 im diploiden Organismus paaren sich auf homologen Chromosomen in der Meiose. Dabei kann es zu ungleichen Crossing Overs kommen, wodurch Deletionen oder Duplikationen von Genen auftreten können.
Wie nennt man den Extremfall, dass das gesamte Genom oder ein großer Chromosomenabschnitt dupliziert wird?
Was ist der Vorteil von Duplikationen?
Polyploidie bezeichnet das Phänomen, mehr als zwei Sätze von Chromosomen in den Zellen zu besitzen. Bei einigen weiteren Arten tritt Polyploidie nur in einzelnen Zellen auf.
Ein einfacher (haploider) Chromosomensatz enthält jedes Chromosom einmal, ein zweifacher (diploider) Chromosomensatz zweimal.
Duplikationen jedweder Art verleihen Organismen hohes Evolutionspotenzial.
Wie sieht die Retrovirale Genom Struktur aus?
Terminal Repeats
Was sind Terminal Repeats (LTRs)?
- Repetitive palindromische DNA-Sequenzen,
-
Wo befinden sich LTRs?
Am 5’- und 3’-Ende der Nukleinsäure von Proviren oder von bakteriellen Transposons.
Wie lang sind LTRs?
100te von bp, bestehend aus sich wdh. Nukleotidsequenzen
LTR: Was ist deren Funktion?
- Schutz vor hydrolytischem Abbau: Ringschluss der revers transkribierten viralen DNA
- Integration unterstützend
- Repeat am 5’-Ende: Wirkung als starker Promoter für Transkription viraler Gene.
Als was bezeichnet man interspersed („verstreute“) Repeats noch?
Transposable elements,
Vorläufer der Retroviren
Interspersed Repeats
Was sind interspersed (verstreute) Repeats?
Wie groß sind sie?
- Wiederholungselemente, die mehrfach an unterschiedlichen Stellen im menschlichen Genom auftauchen.
- Sie haben eine Größe von 100 bis über 1000 Nukleotide.
Tandem Repeats
Was sind Tandem Repeats?
Mit Tandem Repeats beschreibt man die direkte Aufeinanderfolge einer identischen Nukleotidabfolge.
Transposons
Was sind Transposons?
Wieviel % des menschlichen Genoms enthalten inaktive DNA-Transposons?
- Transposon: Elemente des menschlichen Genoms, welche nicht statisch fixiert sind, sondern durch Transposition ihren Standort auf einem Gen ändern können.
- Das Menschliche Genom enthält ca. 3% inaktive DNA-Transposons.
Wie bewegen sich Transposons?
Sie bewegen sich nach CUT & PASTE Mode, das heißt durch die Transposase wird die Target DNA gespalten und Transposon DNA integriert.
Was sind Retrotransposons?
Retrotransposons: Überbleibsel von DNA-Stücken aus Retro-Viren, welche in der infizierten Zelle zurückgeblieben sind und sich in das Genom eingebaut haben.
Welche 3 Arten der Transposons sind Retrotransposons? Codieren Sie für Proteine?
- LINEs (long interspersed nuclear elements) : ja (“autonome Transposons”)
- SINEs (short interspersed nuclear elements): nein
- LTR-Retrotransposons: Es gibt autonome und nicht-autonome LTR-Retrotransposons. Je nach Art Proteinexpression.
Es gibt autonome und nicht autonome LTR-Retrotransposons.
Wer codiert für Proteine?
Autnome, z.B. endogene retrovirale Sequenzen (ERV): kodieren für pol (Gen der reversen Transkriptase).
- Nicht-autonome LTR-Retrotransposons sind nicht mehr aktiv, d.h. es findet keine Transposition mehr statt.
Retrotransponsons
Angelehnt an die Mechanismen der reversen Transkriptase kommt der Namensteil “Retro” zustande.
Wie läuft die Transposition ab?
Wieviel % des menschlichen Genoms machen Retrotransposons aus?
Nach COPY & PASTE Mode:
Virus-RNA wird durch Reverse Transkriptase in cDNA transkribiert.
Doppelsträngige cDNA wird im Zellkern durch Integrase in DNA eingebaut.
Mehr als 40% des menschlichen Genoms.
Wofür steht HDR?
Homology-dependent double strand break repair
Wofür steht HR?
Homologe Rekombination
Wofür steht NHEJ?
Non homologous end joining
Wie funktioniert HDR bei Doppelstrangbrüchen?
Homology-dependent double strand break repair
https://www.youtube.com/watch?v=86JCMM5kb2A
1. Nucleasen entfernen die bp im beschädigten Bereich. Erhalte einzelsträngige 3`-Enden (A-Stränge).
2. Durch Rekombinationsproteine wird einer dieser Einzelstränge mit einem homologen intakten Doppelstrang interagieren und ein D-Loop (Displacement-loop) formen (siehe Bild) .(Doppelstrang aufspalten und an komplementären intakten Einzelstrang binden).
3. Das 3’-Ende von A ist der Primer für die DNA-Synthese im D-Loop. Der komplementäre Strang dient als Template.
4. Es formt sich jedoch kein Doppelstrang mit dem Template, sondern eine Blase aus Template, eine kurze Region der neu hergestellten DNA, und des “displaced strand” bildet sich.
4. Replikationsblase dissoziiert ab und der neu hergestellte Strang wird vom anderen 3-Ende des ursprünglich beschädigten Strangs (A) abgefangen. Dessen 3-Ende dient als Primer für die DNA-Synthese um die Lücke zu schließen. Weiter Lücken werden durch Replikation und Ligase geschlossen.
Im Gegensatz zur Homologie-gerichteten Reparatur werden bei der NHEJ die getrennten Stränge unabhängig von ihrer Sequenz wieder zusammengefügt.
Wie funktioniert NHEJ (non-homologous end joining)?
https://www.youtube.com/watch?v=31stiofJjYw
1. Zufälliger Doppelstrangbruch
2. Erkennen der freien Endstücke durch Ku70/Ku80: Ein Heterodimer, bestehend aus Ku70/Ku80 bindet an die offenen Enden. An Ku70/Ku80 bindet DNA-PKcs, Artemis und DNA-Ligase IV.
3. Bearbeitung der Enden: Einige Nukleotide entfernen und blockierende Hydroxyl- oder Phosphatgruppen modifizieren. Dafür ist DNA-PKcs zuständig.
4. Ligation der Endstücke durch DNA-Ligase IV.
Crispr-Cas
Mit Crispr/Cas kann Gen Knock-out oder Knock-in durchgeführt werden.
Was ist der Unterschied zwischen NHEJ und HDR?
indel= insertion/deletion
https://www.beckman.de/support/faq/research/nhej-hdr-difference
- NHEJ :sehr effizienter Reparaturmechanismus, der in der Zelle am aktivsten ist. Er ist auch anfällig für häufige Mutationsfehler aufgrund von Nukleotideinfügungen und -deletionen (Indels).
- HDR:vorherrschende Mechanismus für die präzise Reparatur von Doppelstrangbrüch, aber wenig effizient.
- Grund:höhere Sequenzähnlichkeit zwischen dem durchtrennten und dem intakten Spender-DNA-Strang erforderlich
- Es treten weniger Fehler oder Mutationen auf, wenn die bei der Reparatur verwendete DNA-Vorlage mit der ursprünglichen, unbeschädigten DNA-Sequenz identisch ist.
