VL 3 Postina: Plasmide Flashcards
Was ist ein Plasmid?
-> Vorkommen?
- Plasmid: zirkuläres, extrachromosomales, doppelsträngiges DNA‐Molekül
- Natürlich vokommend in: Bakterien, Hefen
Wird nach der Zellteilung der Plasmid immer an die Tochterzelle weitergegeben?
- Bei geringer Kopienzahl muss die Weitervererbung exakt geregelt sein
- Wenn Plasmid in ausreichender Kopienzahl vorhanden ist, kann es bei der Zellteilung an die Tochterzelle weitergegeben werden.
Was ist ein F-Plasmid?
Das F-Plasmid (Abk. für Fertilitätsplasmid, auch Fertilitätsfaktor genannt) ist ein spezielles Plasmid, welches Bakterien die Fähigkeit zur Konjugation (horizontaler Gentransfer) verleiht.
Wie funktioniert die Vererbung beim F-Plasmid?
- Spender besitzt den F-Faktor, (wird auch als F+ bezeichnet)
- Empfänger hat keinen F-Faktor (F-).
- Das F-Plasmid mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit auf den Empfänger übertragen.
- Dadurch wird der Empfänger ebenfalls zum Spender. Daher sind alle Bakterienzellen, die ein F-Plasmid besitzen, potentielle Spenderzellen.
-> Mit F-Plasmid gerichteter Gentransfer.
Wie groß ist der F-Plasmid?
Was sind Bestandteile eines F-Plasmids?
- Größe: ca 100kbp
- enthält mehrere ori (Origin of replication)
- Enthält 3 Gencluster für die Replikation (Replicons): RepFIA, RepFIB & RepFIC
Welcher Gencluster ist für die Maintenance (Erhaltung) des F-Plasmids wichtig?
Die sop RepFIA Region:
Pro E.coli‐Zelle sind nur 1‐2 Kopien enthalten, wichtig für Replikation und Verteilung des Plasmids
Was ist ori?
- Origin of replication (eine nicht proteincodierende DNA‐Sequenz), notwendig, damit das Plasmid im Bakterium vervielfältigt werden kann.
- ori‐Region ist Bindungsstelle von Proteinen, die die Replikationsrate beeinflussen
Welchen Einfluss hat ori auf die Kopienanzahl?
- Art des ori bestimmt Anzahl der Kopien pro Zelle (F ori: 1 ‐ 2 Plasmidkopien pro Zelle).
- Anzahl der Kopien ist genetisch reguliert (teilw. Gene des Plasmids beteiligt).
- Mutationen in der ori‐Region können die Kopienzahl beeinflussen (verbesseren / verschlechtern).
F Plasmid (Fertilitätsplasmid) haben eine tra, mob und die nic/bom-Region.
Wofür codiert tra?
Transfergene (tra): Gene zur Bildung des sogenannten F-Pilus und einer DNA-Transferpore.
F Plasmid (Fertilitätsplasmid) haben eine tra, mob und die nic/bom-Region.
Wofür codiert mob?
mob: Mobilsierungsgen
F Plasmid (Fertilitätsplasmid) haben eine tra, mob und die nic/bom-Region.
Wofür codiert die nic/bom-Region.?
nic/bom‐Region:
Hier bindet das Mobilisierungsprotein und erzeugt einen Einzelstrangbruch (nick). Dieser ist für die Mobilisierung notwendig. bom: basis of mobility
Wie erhält man ein bestimmtes DNA-Segment und amplifiziert es?
- Ein DNA-Fragment der gewünschten Größe wird mithilfe von Restriktionsen donucleasen oder durch PCR oder chemische Synthese erzeugt.
- Das DNA-Fragment wird in einanderes DNA-Molekül, einen sogenannten Vektor , eingebaut, der Sequenzen enthält, die seine eigene Replikation ermöglichen.
- Der Vektor mit dem eingefügten DNA-Fragment wird in Zellen eingeführt, in denen er vermehrt werden soll.
- Zellen, welche die gewünschte DNA enthalten, werden identifiziert und selektiert .
Ein Restriktionsfragment kann an einer Schnittstelle des Klonierungsvektors eingefügt werden, wenn dieser mit demselben Restriktionsenzym geschnitten wurde.
Wie läuft allgemein die Klonierung an einem Plasmidvektor ab?
- Ein DNA-Fragment, das kloniert werden soll, wird häufig durch den Einsatz von Restriktionsendonucleasen erhalten. Die meisten Restriktionsenzyme schneiden doppelsträngige DNA, sodass „klebrige Enden“ entstehen.
- Die komplementären Enden der beiden DNAs bilden Basenpaare und werden durch die DNA-Ligase verknüpft
- Transformation: Das Plasmid wird in die Wirtszelle aufgenommen, verbleibt aber nur mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,1% dauerhaft in der Zelle.
- Selektion: Im Falle der Plasmidtransformation kann die Selektion durch den Einsatz von Antibiotika oder chromogenen (färbenden) Substraten erzielt werden.
Hier abgebildet ist der Plasmidvektor pUC18.
Was macht das lacZ-Gen?
Das lacZ-Gen codiert für das Enzym β-Galactosidase. Dieses ist in der Lage, das farblose Substrat X-gal durch Spaltung in einen blauen Farbstoff umzuwandeln.
Hier abgebildet ist der Plasmidvektor pUC18.
Wie selektiert man nach der Transformation Bakterienzellen mit unmodifizierten Plasmidring von Wirtszellen mit rekombinanter DNA? (Hilfsmittel: X-gal)
- Zellen mit unmodifizierten pUC 18 bilden blaue Kolonien.
- Bakterien, in deren Plasmid an der Polylinkerregion eine fremde DNA eingefügt wurde, farblose Kolonien.
->Durch die DNA-Insertion wird as lacZ-Gen unterbrochen, und es wird keine aktive β-Galactosidase gebildet. - Zellen, die den Plasmid aufgenommen haben sind ebenfalls farblos, da sie keine β-Galactosidase haben.
Hier abgebildet ist der Plasmidvektor pUC18.
Wie selektiert man nach der Transformation Bakterienzellen mit modifizierten Plasmidring von Zellen, die den modifizierten Plasmid aufgenommen haben? (Stichwort Antibiotika)
- Durch das Ampicillin-Resistenzgen amp R im Plasmidvektor, können diese Zellen durch die Zugabe des Antibiotikums Ampicillin zum Kulturmedium selektiv entfernt werden.
* Erfolgreich transformierte Bakterienzellen können so dadurch identifiziert werden, dass sie in einem ampicillinhaltigen Medium farblose Kolonien ausbilden. Gene wie amp R werden auch als Selektionsmarker bezeichnet.
Wo ist ein Konjugationsmechanismus wie der bei der Übertragung des F-Faktors bedeutend?
- Bei der Entwicklung von Mehrfachresistenzen, einem fundamentalen Problem der heutigen Antibiotikatherapie.
Wie funktioniert der Mechanismus zur Entwicklung von Mehrfachresistenzen?
- Zirkuläre DNA bringt R-Faktor ein oder mehrere Gene für den Abbau von Antibiotika.
(z.B. b-Lactamase, spaltet b-Lactam-Antibiotika wie Penicillin) - Über Konjugation reichen Bakterien den R-Faktor einschließlich seiner Antibiotikaresistenzgene weiter.
-> Erhalte Bakterienstämme, die multiple Resistenzen aufweisen
Was ist ein Hfr-Stamm?
-> Welchen Einfluss hat ein F-Plasmid?
- Als Hfr-Stamm (Abk. für engl. high frequency of recombination) wird ein Bakterienstamm bezeichnet, der sich durch eine hohe Rekombinationsrate auszeichnet.
- Das F-Plasmid ist bei einer solchen Zelle in das Chromosom integriert, wodurch es zu einer erhöhten Aktivität des F-Faktors kommt.
Mit F+ bezeichnet man den Spender und F- den Empfänger eines F-Plasmids.
Wie entsteht der sogenannte F´-Plasmid?
Welche Gene hat er?
- Durch Ausschneiden des F-Faktors aus dem Chromosom einer Hfr-Zelle entsteht ein F’-Plasmid.
- F`- Plasmid hat abhängig von den Schnittstellen auch bakterieneigene Gene.
Mit F+ bezeichnet man den Spender und F- den Empfänger eines F-Plasmids.
Was passiert mit Spenderzellen nachdem F´-Plasmid gebildet wurde?
-> Wann können F´-Plasmid den F-Faktor übertragen?
- Die Hfr-Zelle wird wieder zu einer F+-Zelle.
- Diese bakteriellen Gene, die auf das F’-Plasmid übertragen wurden, sind allerdings für das Bakterienchromosom verloren.
- Bleiben die tra-Gene bei der Exzision vollständig erhalten, kann das neu entstandene F’-Plasmid durch Konjugation wieder auf F−-Zellen übertragen werden.
Was ist das R1-Plasmid? Wie groß ist er?
- Das R1-Plasmid ist ein kurzes Plasmid, das aus 97 kbp und 120 Genen besteht.
Was ist besonders an der Weiterverbung das R1-Plasmid?
- Es ist als “low copy” Plasmid bekannt, er kommt in relativ wenigen Kopien in einem bestimmten Bakterium vor.
- Effizientes Plasmidstabilisierungssystem, das bei der Stabilisierung von Plasmiden mit mittlerer Kopienzahl hilft.
- Nach der Zellteilung ist in jeder Tochterzelle mindestens eine Kopie vorhanden.
Der R1 Plasmid verleiht vielfältige Antibiotikaresistenzen, die auf andere Bakterien übertragen werden kann.
Nenne 5 Bespiele für Resistenzgene.
- Ampicillin-Restenzgen,
- Kanamycin-Resistenzgen
- Streptomycin-Resistenz.
- Chloramphenicol
- Sulfonamide
