VL 3 Postina: Plasmide Flashcards
Was ist ein Plasmid?
-> Vorkommen?
- Plasmid: zirkuläres, extrachromosomales, doppelsträngiges DNA‐Molekül
- Natürlich vokommend in: Bakterien, Hefen
Wird nach der Zellteilung der Plasmid immer an die Tochterzelle weitergegeben?
- Bei geringer Kopienzahl muss die Weitervererbung exakt geregelt sein
- Wenn Plasmid in ausreichender Kopienzahl vorhanden ist, kann es bei der Zellteilung an die Tochterzelle weitergegeben werden.
Was ist ein F-Plasmid?
Das F-Plasmid (Abk. für Fertilitätsplasmid, auch Fertilitätsfaktor genannt) ist ein spezielles Plasmid, welches Bakterien die Fähigkeit zur Konjugation (horizontaler Gentransfer) verleiht.
Wie funktioniert die Vererbung beim F-Plasmid?
- Spender besitzt den F-Faktor, (wird auch als F+ bezeichnet)
- Empfänger hat keinen F-Faktor (F-).
- Das F-Plasmid mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit auf den Empfänger übertragen.
- Dadurch wird der Empfänger ebenfalls zum Spender. Daher sind alle Bakterienzellen, die ein F-Plasmid besitzen, potentielle Spenderzellen.
-> Mit F-Plasmid gerichteter Gentransfer.
Wie groß ist der F-Plasmid?
Was sind Bestandteile eines F-Plasmids?
- Größe: ca 100kbp
- enthält mehrere ori (Origin of replication)
- Enthält 3 Gencluster für die Replikation (Replicons): RepFIA, RepFIB & RepFIC
Welcher Gencluster ist für die Maintenance (Erhaltung) des F-Plasmids wichtig?
Die sop RepFIA Region:
Pro E.coli‐Zelle sind nur 1‐2 Kopien enthalten, wichtig für Replikation und Verteilung des Plasmids
Was ist ori?
- Origin of replication (eine nicht proteincodierende DNA‐Sequenz), notwendig, damit das Plasmid im Bakterium vervielfältigt werden kann.
- ori‐Region ist Bindungsstelle von Proteinen, die die Replikationsrate beeinflussen
Welchen Einfluss hat ori auf die Kopienanzahl?
- Art des ori bestimmt Anzahl der Kopien pro Zelle (F ori: 1 ‐ 2 Plasmidkopien pro Zelle).
- Anzahl der Kopien ist genetisch reguliert (teilw. Gene des Plasmids beteiligt).
- Mutationen in der ori‐Region können die Kopienzahl beeinflussen (verbesseren / verschlechtern).
F Plasmid (Fertilitätsplasmid) haben eine tra, mob und die nic/bom-Region.
Wofür codiert tra?
Transfergene (tra): Gene zur Bildung des sogenannten F-Pilus und einer DNA-Transferpore.
F Plasmid (Fertilitätsplasmid) haben eine tra, mob und die nic/bom-Region.
Wofür codiert mob?
mob: Mobilsierungsgen
F Plasmid (Fertilitätsplasmid) haben eine tra, mob und die nic/bom-Region.
Wofür codiert die nic/bom-Region.?
nic/bom‐Region:
Hier bindet das Mobilisierungsprotein und erzeugt einen Einzelstrangbruch (nick). Dieser ist für die Mobilisierung notwendig. bom: basis of mobility
Wie erhält man ein bestimmtes DNA-Segment und amplifiziert es?
- Ein DNA-Fragment der gewünschten Größe wird mithilfe von Restriktionsen donucleasen oder durch PCR oder chemische Synthese erzeugt.
- Das DNA-Fragment wird in einanderes DNA-Molekül, einen sogenannten Vektor , eingebaut, der Sequenzen enthält, die seine eigene Replikation ermöglichen.
- Der Vektor mit dem eingefügten DNA-Fragment wird in Zellen eingeführt, in denen er vermehrt werden soll.
- Zellen, welche die gewünschte DNA enthalten, werden identifiziert und selektiert .
Ein Restriktionsfragment kann an einer Schnittstelle des Klonierungsvektors eingefügt werden, wenn dieser mit demselben Restriktionsenzym geschnitten wurde.
Wie läuft allgemein die Klonierung an einem Plasmidvektor ab?
- Ein DNA-Fragment, das kloniert werden soll, wird häufig durch den Einsatz von Restriktionsendonucleasen erhalten. Die meisten Restriktionsenzyme schneiden doppelsträngige DNA, sodass „klebrige Enden“ entstehen.
- Die komplementären Enden der beiden DNAs bilden Basenpaare und werden durch die DNA-Ligase verknüpft
- Transformation: Das Plasmid wird in die Wirtszelle aufgenommen, verbleibt aber nur mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,1% dauerhaft in der Zelle.
- Selektion: Im Falle der Plasmidtransformation kann die Selektion durch den Einsatz von Antibiotika oder chromogenen (färbenden) Substraten erzielt werden.
Hier abgebildet ist der Plasmidvektor pUC18.
Was macht das lacZ-Gen?
Das lacZ-Gen codiert für das Enzym β-Galactosidase. Dieses ist in der Lage, das farblose Substrat X-gal durch Spaltung in einen blauen Farbstoff umzuwandeln.
Hier abgebildet ist der Plasmidvektor pUC18.
Wie selektiert man nach der Transformation Bakterienzellen mit unmodifizierten Plasmidring von Wirtszellen mit rekombinanter DNA? (Hilfsmittel: X-gal)
- Zellen mit unmodifizierten pUC 18 bilden blaue Kolonien.
- Bakterien, in deren Plasmid an der Polylinkerregion eine fremde DNA eingefügt wurde, farblose Kolonien.
->Durch die DNA-Insertion wird as lacZ-Gen unterbrochen, und es wird keine aktive β-Galactosidase gebildet. - Zellen, die den Plasmid aufgenommen haben sind ebenfalls farblos, da sie keine β-Galactosidase haben.
Hier abgebildet ist der Plasmidvektor pUC18.
Wie selektiert man nach der Transformation Bakterienzellen mit modifizierten Plasmidring von Zellen, die den modifizierten Plasmid aufgenommen haben? (Stichwort Antibiotika)
- Durch das Ampicillin-Resistenzgen amp R im Plasmidvektor, können diese Zellen durch die Zugabe des Antibiotikums Ampicillin zum Kulturmedium selektiv entfernt werden.
* Erfolgreich transformierte Bakterienzellen können so dadurch identifiziert werden, dass sie in einem ampicillinhaltigen Medium farblose Kolonien ausbilden. Gene wie amp R werden auch als Selektionsmarker bezeichnet.
Wo ist ein Konjugationsmechanismus wie der bei der Übertragung des F-Faktors bedeutend?
- Bei der Entwicklung von Mehrfachresistenzen, einem fundamentalen Problem der heutigen Antibiotikatherapie.
Wie funktioniert der Mechanismus zur Entwicklung von Mehrfachresistenzen?
- Zirkuläre DNA bringt R-Faktor ein oder mehrere Gene für den Abbau von Antibiotika.
(z.B. b-Lactamase, spaltet b-Lactam-Antibiotika wie Penicillin) - Über Konjugation reichen Bakterien den R-Faktor einschließlich seiner Antibiotikaresistenzgene weiter.
-> Erhalte Bakterienstämme, die multiple Resistenzen aufweisen
Was ist ein Hfr-Stamm?
-> Welchen Einfluss hat ein F-Plasmid?
- Als Hfr-Stamm (Abk. für engl. high frequency of recombination) wird ein Bakterienstamm bezeichnet, der sich durch eine hohe Rekombinationsrate auszeichnet.
- Das F-Plasmid ist bei einer solchen Zelle in das Chromosom integriert, wodurch es zu einer erhöhten Aktivität des F-Faktors kommt.
Mit F+ bezeichnet man den Spender und F- den Empfänger eines F-Plasmids.
Wie entsteht der sogenannte F´-Plasmid?
Welche Gene hat er?
- Durch Ausschneiden des F-Faktors aus dem Chromosom einer Hfr-Zelle entsteht ein F’-Plasmid.
- F`- Plasmid hat abhängig von den Schnittstellen auch bakterieneigene Gene.
Mit F+ bezeichnet man den Spender und F- den Empfänger eines F-Plasmids.
Was passiert mit Spenderzellen nachdem F´-Plasmid gebildet wurde?
-> Wann können F´-Plasmid den F-Faktor übertragen?
- Die Hfr-Zelle wird wieder zu einer F+-Zelle.
- Diese bakteriellen Gene, die auf das F’-Plasmid übertragen wurden, sind allerdings für das Bakterienchromosom verloren.
- Bleiben die tra-Gene bei der Exzision vollständig erhalten, kann das neu entstandene F’-Plasmid durch Konjugation wieder auf F−-Zellen übertragen werden.
Was ist das R1-Plasmid? Wie groß ist er?
- Das R1-Plasmid ist ein kurzes Plasmid, das aus 97 kbp und 120 Genen besteht.
Was ist besonders an der Weiterverbung das R1-Plasmid?
- Es ist als “low copy” Plasmid bekannt, er kommt in relativ wenigen Kopien in einem bestimmten Bakterium vor.
- Effizientes Plasmidstabilisierungssystem, das bei der Stabilisierung von Plasmiden mit mittlerer Kopienzahl hilft.
- Nach der Zellteilung ist in jeder Tochterzelle mindestens eine Kopie vorhanden.
Der R1 Plasmid verleiht vielfältige Antibiotikaresistenzen, die auf andere Bakterien übertragen werden kann.
Nenne 5 Bespiele für Resistenzgene.
- Ampicillin-Restenzgen,
- Kanamycin-Resistenzgen
- Streptomycin-Resistenz.
- Chloramphenicol
- Sulfonamide
Das R1 Plasmid verleiht vielfältige Antibiotikaresistenzen, die auf andere Bakterien übertragen werden kann.
Und welches Transfergen, welches auch der F-Plasmid besitzt, trägt er?
tra-Transfer/Konjugationskassette
pUC19 ist ein Plasmid, der häufig bei gentechnischen Arbeiten verwendet wird. Welche 5 Strukturmerkmale besitzt er?
- Ori: Replikationsursprung
- Amp: kodiert für das Protein ‐Lactamase. Verleiht Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin. Zur Selektion plasmidtragender Bakterien erforderlich.
- MCS: multiple cloning site: Hier kann das Plasmid mit Restriktionsenzymen (z.B SmaI) linearisiert werden. Hier kann dann Fremd‐DNA (z.B. ein PCR‐Produkt) eingebaut werden.
- Plac: Promotor für das LacZ Alpha‐Peptid
- LacZα: kodiert für das Lac Alpha‐Peptid (LacZ: Beta-Galactosidase). Erleichtert die Suche nach Plasmiden mit zusätzlicher DNA in der MCS.
Es gibt Plasmide, die gezielt in das Genom integriert werden können mit dem Flp/FRT-System.
Wie funktioniert das?
Die Flippase bindet an beide Enden der FRT-Sequenz, die auf beiden DNA-Strängen zueinander palindromisch sind. In der Mitte der FRT-Sequenz liegt ein Spacer von 8bp.
Auf dem Plusstrang erfolgt durch die Flippase eine Hydrolyse der DNA vor dem Abstandshalter, auf dem Minusstrang nach dem Abstandshalter.Obwohl verschiedene FRT-Sequenzen bekannt sind, funktioniert eine Rekombination nur zwischen zwei gleichen Sequenzen.
Manche FRT-Sequenzen besitzen in 5’-Richtung eine zusätzliche DNA-Sequenz.
Dieses Segment ist nicht notwendig bei der Entfernung einer DNA-Sequenz (bei einer Deletion), jedoch notwendig für eine Insertion. Die Insertion erfolgt unter Inversion der DNA-Sequenzen.
Was passiert wenn zusätzliche DNA in der MCS von pUC19 eiengebaut wird?
Bei zusätzlicher DNA in der MCS:
1) Im Leserahmen: Expression eines veränderten LacZ‐ alphaPeptid
2) Leserahmenverschiebung: Nonsens‐Protein
Wenn ein Plasmid in Säugerzellen überführt wird kann er unterschiedliche “Schicksale” wiederfahren.
Welche?
- Er kann extrachromosomal lokolisiert werden und ist nur kurzfristig stabil.
- Er kann durch homologe Rekombination zufällig ins Genom intergriert werden.
Es gibt Plasmide, die gezielt in das Genom integriert werden können mit dem Flp/FRT-System.
Was ist das?
Flp=Flippase, eine Recombinase
FRT=FLP recombinase target
Flp bindet an FRT-Sequenzen und rekombiniert sie.
Wie funktioniert das Flp/FRT System?
- Empfängerzell‐Linie hat FRT‐Site im Genom
- Transformierung mit zwei Plasmiden: 1 Plasmid trägt Flippase-Rekombinase-Gen, das andere GOI
3.Flippase katalysiert die Rekombination von FRT-Sequenz und dem gesamten Plasmid, der GOI trägt.
Manche Plasmide sind zur bicistronischen Expression befähigt.
Was versteht man darunter? Wie spiegelt das sich in der Translation wieder?
Bicistromische Vektoren können simultan 2 Proteine getrennt voneinander exprimieren.
Es gibt 2 Arten der Translationsinition:
1. Über die 5´-Cap-Struktur wird die mRNA vom Ribosom erkannt. (Protein 1)
2. Über IRES bindet die mRNA an das Ribosom (Protein 2).
Was IRES?
Wo kommt es vor?
Als IRES (interne ribosomale Eintrittsstelle, engl. internal ribosomal entry site) wird die Sekundärstruktur der mRNA bezeichnet, die ohne weitere so genannte Initiationsfaktoren die Bindung der mRNA an die Ribosomen vermittelt. Dadurch kann die Translation unmittelbar gestartet werden.
