Vl 1 Gimpl: Genforschung Flashcards
Stille-Mutation
Austausch eines Basenpaares, aber keine Veränderung in der Aminosäurenabfolge
Missense-Mutation
Austausch eines Basenpaares mit einer Veränderung in der Aminosäurenabfolge
Nonsense-Mutation
Austausch eines Basenpaares mit einer Veränderung in der Aminosäurenabfolge, so das ein Stoppcodon (Z.B. UGA) entsteht. -> Abbruch der Translation.
Von welcher Richtung wird die DNA abgelesen? (5’ oder 3’)? Von welcher Richtung wird die neu gebildete RNA synthetisiert?
ABLESEN von 3’ nach 5’ SYNTHESE von 5’ nach 3’
Was sind die 6 Voraussetzungen für die PCR?
1) DNA-Templat 2) Primer (2 Stück für sense und antisense) 3) Nukleotide 4) Puffer 5) Mg2+ 6) Thermostabile DNA-Polymerase
Wie wird die PCR ausgewertet?
Mittels Agarose-Gel-Elektrophorese
Prinzip der Sanger-Methode (Kettenabbruchmethode)
PCR mit markierten Primer, dNTPs und zum Kettabbruch ddNTPs je nach Abbruch-Ende ist eine Auftrennung mit Gel-Elektrophorese nach Fragmentlänge möglich > Basensequenz bestimmbar
Prinzip der Pyrophosphat-Methode
Einzeln Nukleotide hinzupipettieren Beim erfolgreichen Einbau von Nukleotid> Abspaltung von Pyrophosphat >Nachweis mit Sulfurylase: Reaktion von hinzu gesetzten APS mit dem Pyrophosphat zu ATP und Sulfat >>ATP-Nachweis mit Luciferin- Luciferase-System: Erzeugung von detektierbaren Lichtquant, Stärke proportional zue Menge an eingebautem Nukleotid >>>Sequenzierung ablesbar Bevor Hinzugabe nächste Nukleotid Abbau überschüssiges Nukleotid mit Apyrase
RT-PCR (reverse transcriptase PCR)
qualitativer Nachweis von Viren Erzeugung eines Hybridstrangs: Synthese cDNA aus mRNA mittlels reverser Transkriptase Hydrolyse führt zur Abspaltung mRNA durch PCR Erzeugung zweiter cDNA Strang>> cDNA Doppelstran, an dem Einzelstränge hinzugefügt werden können > Einbau in cloning vector Möglich
Real time PCR
Wofür wir es eingesetzt? Wie funktioniert es?
Anwendung:Quantifizierung der Virusmenge über Fluoreszenzsignal Bestimmung von Polymorphismen/Genexpressionsprofils 1.DNA Doppeltstrang Denaturierung und Trennung in Einzelstränge 2. FRET-Sonde (Fluoreszenz-Reporter, Förster-Radius und Quencher) 3. Polymerisation, Anlagerung der Primer 4. Start der PCR, Verdrängung der Sonde bis zur Abspaltung des Fluoreszenz-Reporters 5. Lichtsignal wird nicht gequencht> Aussenden Fluoreszenzstrahlung 6. Polymeristaion vervollständigen, 1 Zyklus 1 Lichtsignal
Ct-Wert
Zyklenzahl, bei der zum ersten Mal ein Anstieg der Reporter-Fluoreszenz über das Grundrauschen ermittelt wird.
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
Wie funktioniert die RFLP-Analyse (Southern Plot)?
1.DNA+ Restriktionsenzyme> Restriktionsfragemente 2. Elektrophorese 3. Southern Blot: Übertragung Gel auf Nitrocellulose Papier, Denaturierung der Einzelstränge 4. Hybridisierung mit Radioaktiver Probe 5. Audioradiographie: Fotofilm wird durch Radionukleotide angeschwärzt>Bandenmuster
VNTR
Wie lange sind sie?
Wo befinden sie sich?
Various Number of Tandem Repeats: 11-60 bp als repeat-Sequenzen
Befinden sich am Chromosomenende (Telomer)
Genlocus
Physische Position eines Gens im Genom (=der Genort)
Allel-Spezifische-Hybridisierung über Real-time PCR: Genotypisierung
Wie funktioniert das?
Testprinzip: Unterscheidung zweier DNA Moleküle, die in einer Base variieren(SNP), mittels Hybridisierung FRET-Sonden + SNP Sequenzen Sonden spezifisch für DNA Genotypen wenn Sonden komplementär zu entsprechendem Allel Ablauf der Real-time PCR und Fluoreszenzlicht wenn diese Sonde nicht komplementär kein Signal
Allel-Spezifische-Hybridisierung über MALDI-TOF-MS: Genotypisierung
Wie funktioniert das?
Testprinzip: Unterscheidung zweier DNA Moleküle, die in einer Base variieren(SNP), mittels Hybridisierung 1.Einsatz forward-Primer, der direkt an dem nachzuweisenden Nukleotid bindet 2.PCR mit komplementäres Didesoxynukleotid (ddNTP) als Kettenabbruch Nukleotid 3.Erhalte Primer+ ddA oder ddG oder ddC oder ddT (MALDI) 4. Nachweis über MALDI über Zunahme des Massenpeaks welches Abbruchnukleotid eingebunden
Nachweis differentieller Genexpression
Zum Nachweis von Genexpression werden DNA-microarrays verwendet.
Wie funktionieren diese “DNA-chips”?
https://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM
- mRNA von Probe 1 wird mit roten Fluoreszensfarbstoff markiert und in cDNA umgewandelt.
mRNA von Probe 2 (Z.B. Referenz) wird mit grünen Fluoreszenzfarbstoff markiert und in cDNA umgewandelt.
- Genspezifische DNA wird amplifiziert und zusammen mit cDNAs der Proben auf Glasträger immobilisiert.
- An komplementären DNA - Abschnitten findet Hybridisierung statt. Ungepaarte DNA wird durch Waschen entfernt.
- Erhalte Fluoreszenzsignale.
Grün : Dieses Gen wird nur von Probe 1 exprimiert.
Rot: Dieses Gen wird nur von Probe 2 exprimiert.
Gelb: Überlagerung: Gen wird von beiden Proben exprimiert.
Lokalisierung eines Gens auf dem Chromosomen
Um die genaue Lage eines Genes auf dem Chromosom anzugeben wird eine Art Code verwendet: [Chromosomen-Zahl] [Sektion: p oder q] [Region].
In der Literatur findet man, dass das Gen CFTR in 7q31.2 lokalisiert ist.
Was heißt das?
- Auf Chromosom 7 ( 1-22 sind Autosomen, X oder Y sind die Sex-Chromosomen)
- q- langer Arm. (Ein Chromosomen besteht einen langen Arm (q) und einem kürzeren Arm (p).)
- 31.2 gibt die Position an: Vom Centomer gezählt, wäre das Bande 31. (Je größer die Nummer desto weiter ist der Abstand). Es gibt mehrere Subbanden bei 31, hier liegt das Gen auf Subbande 2.
Wie sind Zinkfinger-Nuclease aufgebaut?
Fusionsprotein:
FokI-Domäne (unspezifische Nuclease, Nuclease ist als dimer aktiv) +
DNA-Bindungsdomäne, mit Zinkfingermotiven.
→ Dadurch spezifisches Schneiden!
Wieviele Basenpaare erkennt ein Zinkfinger?
Wie groß muss das Genom mindestens sein, damit eine Zinkfingernuclease selektiv schneiden kann?
Ein Zinkfinger erkennt 3 bp.
Pro Nuclease sind 4 Zinkfinger gebunden. Das heißt die Nuclease, die (nur als Dimer aktiv ist) kann (2 × (3+3+3+3)=24 bp) erkennen.
(Für 1 selektiven Schnitt im Genom muß die Erkennungsregion ~20 bp gross sein! )
