Vortrag Gruppe 8: Drug Discovery Targeting Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK)

Question 1

Was verstehen Sie unter einem „ALK-Fusionsprotein“ und beschreiben Sie!

Answer 1

Fusionsprotein: Gemeinsame Expression zweier dicht hintereinander liegender Gene bzw. Genabschnitte.

ALK-Fusionsproteine: Fusion Kinasedomäne und der N-terminale Teil von unterschiedlichen Proteinpartnern.

• Gegenwärtig sind fast 30 Fusionsproteine der ALK onkogene Treiber in vielen Krebsarten
• Häufigste Varianten sind EML4-ALK (NSCLC) und NPM-ALK (ALCL).

Question 2

Welche Resistenzen können gegen ALK-Inhibitor-Therapie auftreten?

Answer 2

• regelmäßig Auftreten von Mutationen
• verantwortlich für erworbene Resistenz gegen die ALK-Inhibitor-Therapie

Es wird unterschieden zwischen

• ALK-abhängigen Resistenzen
• ALK-unabhängigen Resistenzen

Question 3

Wie werden ALK aktiviert?

Answer 3

Question 4

Wie wird die ALK aktiviert?

Answer 4

• Extrazellulär Induzierung von Liganden
  
  • Dimerisierung
  • Übertragung der extrazellulären SIgnale durch diverse intrazellulärer Signalwege

Question 5

Was ist ALK?

Wann oft wird das humane ALK im Menschen hauptsächlich exprimiert?

Answer 5

Anaplastische Lymphom-Kinase = Rezeptor Tyrosin Kinase

• vorwiegend während der Fetalzeit (Neurogenese) exprimiert
• als Erwachsener niedrige Konzentrationen

Question 6

Was zeigt die ALK an?

Answer 6

Erhöhte ALK-Aktivität bei verschiedene Krebsarten

• Non-Hodgkin-Lymphom
• NSCLC (Non-small cell lung cancer)
• Schilddrüsenkrebs
• Neuroblastom

Question 7

Wie ist die humane ALK aufgebaut?

Answer 7

• Signalpeptid
• extrazelluläre Liganden-Bdgs.domäne
• Transmembrandomäne
• intrazelluläre Tyrosinkinase-Domäne

Question 8

Wie verändert sich die ALK bei Krebs?

Was ist dabei das Problem?

Answer 8

• häufigste genetischen Veränderungen: chromosomale Umlagerungen und Tramslokationen
• Bildung von ALK-Fusionsproteinen
• Bildung multipler Fusionsgenen

Problem: Aktivierung auch ohne Liganden möglich

Question 9

Welche Probleme treten durch ALK-Fusionsproteine auf?

Answer 9

• aktivierende Veränderung
• Keine Ligandenabhängigkeit
  
  • Durch Hyperphosphorylierung und/oder Überexpression konstitutiv aktiv
  • Downstream-Aktivierung proliferatischer und antiapoptotischer Signale über intrazelluläre Signalwege

Question 10

Welche ALK-abhängigen Resistenzmechanismen gibt es?

Beispiel?

Answer 10

• Punktmutation innerhalb des Targets
• Amplifikation des ALK-Gens

Beispiel: Crizotinib-Resistenz durch Punktmutation

Leucin: Gatekeeper-Rest in der Nahe der ATP-Tasche und der Bdgstasche des Arzneistoffs

Mutation: Austausch Leucin durch Methionin

Question 11

Was bewirkt die Punktmutation die z.B. bei der Therapie mit Crizotinib auftritt?

Answer 11

• Förderung der Bildung der AKTIVEN Protein-Konformation durch:
  
  • Sterische Behinderung der hydrophoben Tasche
  • Erhöhung der Aktivität durch Stärkung des hydrophoben Rückgrats

Question 12

Welche ALK unabhängigen Resistenzmechanismen gibt es?

Answer 12

• Aktivierung von Bypass-Signalwegen:
  
  • Aktivierung EGFR
  • Mutationen im KRAS-Gen
• Veränderungen in der Morphologie:
  
  • Epithel-zu-Mesenchym-Transition (EMT)
  • Histologische Transformation von NSCLC-Entität zu SCLC

Question 13

Erklären Sie anhand der Kristallstruktur die typischen Bereiche der ALK und den Bindemodus für ATP!

Answer 13

• Amino-endständiges N-Segment & ein Carboxyl-endständiges C-Segment
• durch eine flexible „hinge region“ verbunden.
• Zwischen N- und C-Segment liegt eine Kluft mit ATP-Bindetasche
• zwei hydrophobe Rückgrate: regulatorische R-Rückgrat und das katalytische C-Rückgrat (im N- und auch im C-Segment, Verbindung durch Gatekeeper-Rest (L1196))
• für die katalytische Aktivität ua AS Lys1150, Glu1167, Asp1249 und Asp1270 (in der ATP-Bindetasche) und das DFG-Motiv im A-Loop.

Question 14

Wie ist das N-Segment aufgebaut?

Answer 14

Es besteht hauptsächlich aus :

• fünf β-Faltblättern
• αC-Helix, die eine wichtige regulatorische Funktion besitzt.
• Zusätzlich gibt es noch eine glycinreiche Struktur („glycine loop“),
  
  • für die koordinierende Bindung an die Phosphate β und γ des ATPs verantwortlich

Question 15

Wie ist das C-Segment aufgebaut?

Answer 15

Es beinhaltet :

• sechs α-Helices (αD-αI)
• zwei β-Stränge (β7-β8).
• IA-Loop, dessen Tyrosinreste phosphoryliert werden können.
  
  • Regulation der Enzymaktivität:

Wenn die ALK unphosphoryliert vorliegt, existiert eine weitere Helix (αEF).

Question 16

Wie wirken die hydrophoben Rückgrate sich auf die Enzymaktivität aus?

Answer 16

• R-Rückgrat: In Abhängigkeit der Phosphorylierung der A-Loop in der Aktivierungsregion Konformationsänderung
  
  • Beeinflusst die Position des Substrats in der Bindetasche.

→ Dadurch wird die Aktivität des Enzyms reguliert.

• C-Rückgrat: Regulation der Katalyse, beeinflusst Position des ATPs in der Bindetasche

Question 17

Die DFG-Konformation ist für die Kinaseaktivität wichtig.

Was für DFG-Konformationen gibt es?

Answer 17

• Aktiver Zustand: DFG-in-Konformation
• Seitenkette des Asp zur ATP-Bdgstasche orientiert und aromatische Ring des Phenylalanins in die hintere Tasche → direkter Kontakt zur αC-Helix.
• Inaktive Kinase 2 Konformationen: DFG-out und DFG-out-like.
• DFG-out: Aromatischer Ring des Phenylalanins zeigt in die ATP-Bdgstasche und das Asp zur hinteren Tasche, von der Bindestelle weg.

Question 18

Erklären Sie anhand von Strukturen und den Testdaten die Strategie des Designs von Crizotinib.

Ausgangsverbindung: Ein moderater c-Met-Inhibitor.

Answer 18

• 2fache Substitution : Bessere Ausfüllung der Bindetasche
• Bioisosterer Austausch → Erhöhte Aktivität und Potenz des Inhibitors, aber erniedrige Permeabilität, geringe Löslichkeit sowie eine hohe metabolische Clearance
• Structure-based drug design: Ringschluss zum Carbazol , danach wurde eine Ringspaltung vorgenommen und zum Schluss die Sulfonylbenzylstruktur entfernt → H-Brücken, polarer und lösliche
• Geringere Aktivität, eine Substitution eines Wasserstoffatoms am 2,6-Dichlorphenylring durch ein Fluoratom → Aktivität und Lipophilie größer
• Enantiomerentrennung: bessere Affinität

Question 19

Erklären Sie die Strategie bei der Entwicklung von Ceritinib aus TAE 684! Vergleichen Sie auch Brigatinib mit TAE 684 und die besondere Bedeutung der Phosphinoxid-Gruppe!

Answer 19

TAE: Problem Toxizität wegen cip-Oxidation

• Umdrehen des Piperidinrings, keine Oxidatiion möglich

Brigatinib: cip-Oxidation möglich, aber nur geringer Teil , Grund:erhöhte Polarität durch Austausch Sulfongruppe gegen DMPO

Dimethylphosphinoxid (DMPO):

• Wechselwirkung mit dem DFG Motiv
• 3 Substituenten und zusätzlich HBA >Stabilisierung einer U-förmigen Konformation in der Bindetasche

Question 20

Zeigen Sie den Bindemodus von Crizotinib (ALK-Inhibitor 1. Generation) und die Auswirkung der L1196M-Mutation!

Answer 20

• Am Aminopyridinring mit Glu1197 und Met1199 H-Brückenbindungen
• DFG-Motiv im A-Loop liegt in DFG-in-Konformation vor
• Im Vergleich zu Leucin ist Methionin etwas größer.
• Methionin blockiert die hydrophobe Bindetasche.
• Zusätzlich wird die Enzymaktivität erhöht: Das regulatorische R-Rückgrat wird verstärkt → So kann Enzym leichter in die aktive Konformation

Question 21

Beschreiben Sie das neuartige PROTAC-Prinzip gerade im Hinblick auf Kinase-Inhibitoren!

Answer 21

Pomalidomid = E3-Ligand

Vorteil:

• Funktioniert auch bei resistenten Mutanten (z.B. Ceritinib wirkt als PROTAC auch bei EML4-ALK)
• Protein nicht nur gehemmt, sondern eliminiert

schneller Abbau der ALK !!

Question 22

Wie funktioniet allgemein das PROTAC-Prinzip?

Answer 22

Protac = Crossinker von POI (Protein of Intrest) und E3-Ligase mit Ubiquitinrest

• Besteht aus POI-Ligand+Linker+E3-Ligand
• Durch Bindung wird POI von Ligase zersetzt
• Übertragung von Ubiquitin auf Fragmente (Polyubiquitinierung)
• Markierte Fragmente werden von Proteosomen degradiert