Vortrag Gruppe 8: Drug Discovery Targeting Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Flashcards
Was verstehen Sie unter einem „ALK-Fusionsprotein“ und beschreiben Sie!
Fusionsprotein: Gemeinsame Expression zweier dicht hintereinander liegender Gene bzw. Genabschnitte.
ALK-Fusionsproteine: Fusion Kinasedomäne und der N-terminale Teil von unterschiedlichen Proteinpartnern.
- Gegenwärtig sind fast 30 Fusionsproteine der ALK onkogene Treiber in vielen Krebsarten
- Häufigste Varianten sind EML4-ALK (NSCLC) und NPM-ALK (ALCL).
Welche Resistenzen können gegen ALK-Inhibitor-Therapie auftreten?
- regelmäßig Auftreten von Mutationen
- verantwortlich für erworbene Resistenz gegen die ALK-Inhibitor-Therapie
Es wird unterschieden zwischen
- ALK-abhängigen Resistenzen
- ALK-unabhängigen Resistenzen
Wie werden ALK aktiviert?
Wie wird die ALK aktiviert?
- Extrazellulär Induzierung von Liganden
- Dimerisierung
- Übertragung der extrazellulären SIgnale durch diverse intrazellulärer Signalwege
Was ist ALK?
Wann oft wird das humane ALK im Menschen hauptsächlich exprimiert?
Anaplastische Lymphom-Kinase = Rezeptor Tyrosin Kinase
- vorwiegend während der Fetalzeit (Neurogenese) exprimiert
- als Erwachsener niedrige Konzentrationen
Was zeigt die ALK an?
Erhöhte ALK-Aktivität bei verschiedene Krebsarten
- Non-Hodgkin-Lymphom
- NSCLC (Non-small cell lung cancer)
- Schilddrüsenkrebs
- Neuroblastom
Wie ist die humane ALK aufgebaut?
- Signalpeptid
- extrazelluläre Liganden-Bdgs.domäne
- Transmembrandomäne
- intrazelluläre Tyrosinkinase-Domäne
Wie verändert sich die ALK bei Krebs?
Was ist dabei das Problem?
- häufigste genetischen Veränderungen: chromosomale Umlagerungen und Tramslokationen
- Bildung von ALK-Fusionsproteinen
- Bildung multipler Fusionsgenen
Problem: Aktivierung auch ohne Liganden möglich
Welche Probleme treten durch ALK-Fusionsproteine auf?
- aktivierende Veränderung
- Keine Ligandenabhängigkeit
- Durch Hyperphosphorylierung und/oder Überexpression konstitutiv aktiv
- Downstream-Aktivierung proliferatischer und antiapoptotischer Signale über intrazelluläre Signalwege
Welche ALK-abhängigen Resistenzmechanismen gibt es?
Beispiel?
- Punktmutation innerhalb des Targets
- Amplifikation des ALK-Gens
Beispiel: Crizotinib-Resistenz durch Punktmutation
Leucin: Gatekeeper-Rest in der Nahe der ATP-Tasche und der Bdgstasche des Arzneistoffs
Mutation: Austausch Leucin durch Methionin
Was bewirkt die Punktmutation die z.B. bei der Therapie mit Crizotinib auftritt?
- Förderung der Bildung der AKTIVEN Protein-Konformation durch:
- Sterische Behinderung der hydrophoben Tasche
- Erhöhung der Aktivität durch Stärkung des hydrophoben Rückgrats
Welche ALK unabhängigen Resistenzmechanismen gibt es?
- Aktivierung von Bypass-Signalwegen:
- Aktivierung EGFR
- Mutationen im KRAS-Gen
- Veränderungen in der Morphologie:
- Epithel-zu-Mesenchym-Transition (EMT)
- Histologische Transformation von NSCLC-Entität zu SCLC
Erklären Sie anhand der Kristallstruktur die typischen Bereiche der ALK und den Bindemodus für ATP!
- Amino-endständiges N-Segment & ein Carboxyl-endständiges C-Segment
- durch eine flexible „hinge region“ verbunden.
- Zwischen N- und C-Segment liegt eine Kluft mit ATP-Bindetasche
- zwei hydrophobe Rückgrate: regulatorische R-Rückgrat und das katalytische C-Rückgrat (im N- und auch im C-Segment, Verbindung durch Gatekeeper-Rest (L1196))
- für die katalytische Aktivität ua AS Lys1150, Glu1167, Asp1249 und Asp1270 (in der ATP-Bindetasche) und das DFG-Motiv im A-Loop.
Wie ist das N-Segment aufgebaut?
Es besteht hauptsächlich aus :
- fünf β-Faltblättern
- αC-Helix, die eine wichtige regulatorische Funktion besitzt.
- Zusätzlich gibt es noch eine glycinreiche Struktur („glycine loop“),
- für die koordinierende Bindung an die Phosphate β und γ des ATPs verantwortlich
Wie ist das C-Segment aufgebaut?
Es beinhaltet :
- sechs α-Helices (αD-αI)
- zwei β-Stränge (β7-β8).
- IA-Loop, dessen Tyrosinreste phosphoryliert werden können.
- Regulation der Enzymaktivität:
Wenn die ALK unphosphoryliert vorliegt, existiert eine weitere Helix (αEF).
Erklären Sie anhand von Strukturen und den Testdaten die Strategie des Designs von Crizotinib.
Ausgangsverbindung: Ein moderater c-Met-Inhibitor.
- 2fache Substitution : Bessere Ausfüllung der Bindetasche
- Bioisosterer Austausch → Erhöhte Aktivität und Potenz des Inhibitors, aber erniedrige Permeabilität, geringe Löslichkeit sowie eine hohe metabolische Clearance
- Structure-based drug design: Ringschluss zum Carbazol , danach wurde eine Ringspaltung vorgenommen und zum Schluss die Sulfonylbenzylstruktur entfernt → H-Brücken, polarer und lösliche
- Geringere Aktivität, eine Substitution eines Wasserstoffatoms am 2,6-Dichlorphenylring durch ein Fluoratom → Aktivität und Lipophilie größer
- Enantiomerentrennung: bessere Affinität
Zeigen Sie den Bindemodus von Crizotinib (ALK-Inhibitor 1. Generation) und die Auswirkung der L1196M-Mutation!
- Am Aminopyridinring mit Glu1197 und Met1199 H-Brückenbindungen
- DFG-Motiv im A-Loop liegt in DFG-in-Konformation vor
- Im Vergleich zu Leucin ist Methionin etwas größer.
- Methionin blockiert die hydrophobe Bindetasche.
- Zusätzlich wird die Enzymaktivität erhöht: Das regulatorische R-Rückgrat wird verstärkt → So kann Enzym leichter in die aktive Konformation
Beschreiben Sie das neuartige PROTAC-Prinzip gerade im Hinblick auf Kinase-Inhibitoren!
Pomalidomid = E3-Ligand
Vorteil:
- Funktioniert auch bei resistenten Mutanten (z.B. Ceritinib wirkt als PROTAC auch bei EML4-ALK)
- Protein nicht nur gehemmt, sondern eliminiert
schneller Abbau der ALK !!
Wie funktioniet allgemein das PROTAC-Prinzip?
Protac = Crossinker von POI (Protein of Intrest) und E3-Ligase mit Ubiquitinrest
- Besteht aus POI-Ligand+Linker+E3-Ligand
- Durch Bindung wird POI von Ligase zersetzt
- Übertragung von Ubiquitin auf Fragmente (Polyubiquitinierung)
- Markierte Fragmente werden von Proteosomen degradiert
