Gruppe 19: PROTAC und SHP2 Protein Flashcards
Was ist SHP2?
Wo liegt hier das Problem?
SHP2 ist eine Protein Tyrosin Phosphatase (PTP)
-> Src-Homologie-2 (SH2)-Domäne enthaltende Phosphatase 2
Schwierig durch klassische Inhibitoren zu hemmen (“undruggable”)
Was sind PROTACS?
Wie wirken sie auf SHP2?
Verbindung aus einem SHP2-Liganden und einem E3-Ligase-Liganden, welche über einen Linker kovalent aneinander gebunden sind.
Effektive Inhibition von SHP2 durch gezielte Degradation
Welche Gruppe von Enzymen übt eine zu den PTP gegensätzliche Aufgabe aus? Das Gleichgewicht zwischen diesen beiden Prozessen ist ein Beispiel für die posttranslationale Modifikation von Proteinen. Welchen Zweck erfüllt diese hier allgemein und welche weiteren Beispiele hierfür kennen Sie?
Enzyme mit zu den PTPs gegensätzlicher Aufgabe: Protein Tyrosin Kinasen (PTKs)
Die reversible Tyrosinphosphorylierung wird durch die ausgewogene Aktivität von Protein-Tyrosinkinasen (PTKs) und Protein-Tyrosinphosphatasen (PTPs) gesteuert. Sie reguliert wichtige Signalwege, die an der Kontrolle von Zellproliferation, Adhäsion und Migration beteiligt sind. Proteine werden an ihren Tyrosinresten durch Protein-Tyrosinkinasen phosphoryliert und durch Protein-Tyrosinphosphatasen dephosphoryliert. Zwei Klassen von PTKs sind in Zellen vorhanden: die Transmembranrezeptor-PTKs und die Nichtrezeptor-PTK
Beispiele für Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTKs)
- > Wo sind sie in der Zelle lokalisiert?
- > Was bewirken sie?
Epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), der Thrombocyten abgeleitete Wachstumsfactor-Rezeptor (PDGFR) und der Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor (FGF)
Sind intrazelluläre zytoplasmatische Proteine oder and der Zellmembran verankert
Lösen intrazelluläre Signale aus, die von extrazellulären Rezeptoren abgeleitet sind.
Beispiele für Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen (NRTKs)
Beispiele: Src, Januskinasen und Abl (Abelson murine leukemia viral oncogene homolog).
Was ist das Ziel der Tyrosin Phosphorylierung für SHP2?
SHP2 ist für die Aktivierung des Ras-ERK-Signalweges (extrazelluläre signalregulierte Kinase) als Reaktion auf Wachstumsfaktoren erforderlich und fungiert somit als positiver Regulator der RTK-Signaltransduktion.
Ohne Upstream-Stimulation wird SHP2 durch Interaktion der N-terminalen SH2-Domäne mit der Protein-Tyrosin-Phosphatase-Domäne (PTP) in einem Zustand geringer Aktivität gehalten. Die Bindung eines Phosphotyrosyl-(pY)-Peptids an die SH2-Domäne induziert eine Konformationsänderung, die die Struktur entfaltet und den Substraten den Zugang zur katalytischen Stelle des Enzyms ermöglicht. Die Interaktion von SHP2 mit pY-Proteinen, wie Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTK), Zytokinrezeptoren und Gerüstadaptern (z.B Gab1), vermittelt nachgeschaltete Signalereignisse, die Proliferation, Differenzierung, Migration, Zellzyklusprogression und Apoptose kontrollieren.
Was sind posttranslationale Modifikationen?
Unter posttranslationaler Modifikation (PTM) von Proteinen versteht man die chemischen Veränderungen, die nach der Herstellung eines Proteins auftreten. Sie kann die Struktur, Lokalisation, Stabilität und Interaktionen von Proteinen beeinflussen. Es gibt reversible und irreversible posttranslationale Modifikationen, die anhand ihrer Protein-Modifikation weiter unterteilt werden.
Reversible, basiert auf die Addition von:
- funktionellen Gruppen (Phosphorylierung, Acetylierung, Hydroxylierung, Methylierung u. a.)
- komplexen Molekülen/Polypeptiden (Prenylierung, Glykosylierung, Ubiquitinylierung)
Irreversible, basiert auf
- Abbau (Proteolyse)
- Modifizierung von Aminosäuren (Desaminierung, Eliminierung)
Welchem “klassischen” Inhibitortypus entsprechen die Effekte der PROTACs am ehesten? Inwiefern unterscheiden sich die beiden voneinander?
PROTACs können nach Förderung der Polyubiquitinierung des POI im Vergleich zu irreversiblen Inhibitoren erfolgreich dissoziieren. Dieser katalytische Prozess bietet ein großes Potential für die Ermöglichung der PROTAC-Wirkung bei sehr niedrigen Dosen. Im Gegensatz zu den klassischen Inhibitoren ist der PROTACs induzierte Abbau kein besetzungsabhängiger Prozess, sondern eher ein ereignisgesteuerter Prozess. Zusätzlich ist der PROTAC-induzierte Abbau wiederholend und daher weniger anfällig für eine Erhöhung der Targetexpression.
Der irreversible Inhibitortyp wäre mit dem Effekt der PROTACs der induzierten Degradation eher vergleichbar, denn durch seine kovalente Bindung an das POI ist eine Konformationsänderung des POI möglich. In Bezug auf die Bindung des PROTACs wäre der reversible nicht-kompetitive Inhibitortyp eher vergleichbar.
Warum erschwert eine hohe Sequenzkonservierung in der active site einer Proteinfamilie die Entwicklung von Arzneistoffen für ein Target?
-> Wie kann man dies umgehen?
Um eine spezifische Wirkung im Körper zu erzielen und möglichst wenig unerwünschte Nebenwirkungen zu generieren, sollten Arzneistoffe selektiv an ihre Targets binden. Eine hohe Sequenzkonservierung in der active site einer ganzen Proteinfamilie erschwert dieses Ziel. Inhibitoren, welche an die active site eines Proteins der Familie binden, können auch einen nahen Verwandten derselben Proteinfamilie hemmen. Die Selektivität eines Arzneistoffes ist damit nicht gegeben.
Ein Beispiel hierfür ist die Familie der Protein Tyrosin Phosphatasen (PTP). Es gibt mehr als 100 Gene die dieses Protein mit derselben Sequenz ((I/V)HCXAGXGR(S/T)) in der active site codieren. In der Sequenz enthalten ist das katalytische Cys für die nukleophile Katalyse. Bindung und Hydrolyse von pTyr ist demnach konserviert unter den PTPs. Wird ein Inhibitor entwickelt, der nur durch Bindung an die active site ein Enzym hemmt, kann es zusätzlich zur Inhibition verwandte Proteine der PTP Familie kommen. Um dies zu verhindern, wurden bivalente Moleküle entworfen, welche zusätzlich zu der Bindung an der active site an eine spezifische periphere Tasche des Targets bindet. Eine zweite Möglichkeit dieses Problem zu umzugehen, ist die Entwicklung der PROTACs.
Was bedeutet “WST” und wie funktioniert es?
WST steht für: Water-soluble tetrazolium salts / [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium-mononatrium salz]. Es handelt sich hierbei um ein wasserlösliches Tetrazolium-Molekül, welches als Färbemittel zur kolorimetrischen Bestimmung der Anzahl an lebensfähigen Zellen bei Induktion und Inhibition Versuchen von Zellproliferation verwendet wird.
Lebensfähige Zellen produzieren reduzierende Agenzien wie NADH, welche das Tetrazolium-Kation zum gelbfarbenen Formazan reduzieren. Die Menge an umgesetzten WST-8 ist dabei direkt proportional zur Anzahl an lebensfähigen Zellen im Medium. Durch die Messung der Absorption bei 460 nm und die Auftragung gegen die Konzentration des Inhibitors, wird eine sigmoidale Dosis-Wirkungs-Kurve erhalten. Aus ihr kann der IC50-Wert entnommen werden.
Im Vergleich zu herkömmlichen Agenzien wie MTT oder WST-1, besitzt WST-8 viele Vorteile.
Was für Vorteile hat WST-8 (“WST”) gegenüber MTT oder WST-1?
Im Vergleich zu herkömmlichen Agenzien wie MTT oder WST-1, besitzt WST-8 viele Vorteile.
Zum einen ist die Zubereitung der MTT Lösung aufwendiger. Das MTT Pulver muss erst in Pufferlösung gelöst werden. Nach einer Filtration kann die Lösung nur bei -20°C über einen längeren Zeitraum gelagert werden. WST-8 kommt hingegen fertig als Lösung an und wird bei 4°C gelagert.
Auch die Mechanismen der beiden Agenzien unterscheiden sich. MTT durchquert die Zellmembran und wird direkt im Zytosol reduziert. Es bilden sich unlösliche Kristalle in der Zelle, welche noch nicht detektierbar sind. Dazu muss überschüssiges Medium durch DMSO ersetzt werden. Nach einer zwei stündigen Inkubation haben sich die Kristalle gelöst und die Absorption kann bei 540 nm gemessen werden.
Beim WST-8 Assay sind weniger Schritte notwendig. Dieses Reagenz kann die Zellwand nicht passieren und ist auf die Hilfe von Elektronen Mediatoren (EM) angewiesen. Die EM passieren die Zellwand, nehmen ein Elektron von NADH auf und können so, nachdem sie die Zelle wieder verlassen haben, das WST-8 extrazellulär reduzieren. Dadurch, dass WST-8 wasserlöslich ist färbt sich das Medium direkt gelblich und es kann sofort die Absorption gemessen werden.
Zusätzlich zur leichteren Durchführung der WST-8 Assay zeigte sie eine höhere Sensitivität und Reproduzierbarkeit gegenüber der MTT Assay.
Nehmen Sie Stellung dazu, inwiefern die beiden Parameter “Aktivität” und “Selektivität” des Target-Liganden (“Inhibitor”) in einem PROTAC noch von Relevanz sind.
Mit Hilfe der PROTAC-Strategie wird die Entfernung/der Abbau eines Targets gezielt. Ein PROTAC-Degrader besitzt neben einen Target-Liganden einen E3-Ubiquitin-Ligase-Liganden, welche über einen Linker verknüpft sind. Damit der Mechanismus erfolgreich ablaufen kann muss der Target-Ligand am Zielprotein binden. Für die Bindung des Liganden am Target ist eine hohe Selektivität sehr wichtig; weniger von Bedeutung ist die Bindestelle. Durch die selektive Bindung am Zielprotein kann die Ubiquitinierung und damit der Abbau dieses Proteins erfolgen. Da der Abbau recht schnell erfolgt spielt insgesamt die Aktivität eine geringere Rolle.
Was sind active site Inhibitoren?
Was kann man über den Wirkstoff sagen?
Was kann man über die Aktivität und die Selektivität sagen?
Von kompetitiven bzw. active site Inhibitoren wird gesprochen, wenn diese am aktiven Zentrum des Proteins binden und so die Hemmung des Proteins hervorrufen. Solche Hemmstoffe weisen zumeist eine substratähnliche Struktur auf und konkurrieren mit dem Substrat um die katalytische Bindestelle am Enzym. In diesem Fall spielen beide Parameter eine wichtige Rolle, sowohl die Aktivität als auch die Selektivität.
Wie vermitteln allosterische Inhibitoren ihre Wirkung?
Was kann man über den Wirkstoff sagen?
Was kann man über die Aktivität und die Selektivität sagen?
Nach der Bindung eines allosterischen Inhibitors am Target folgt eine Konformationsänderung am katalytischen Zentrum, sodass die Ausbildung der Substrat-Enzym-Bindung gehemmt wird. Auch hier sind beide Parameter wichtig.
In welchem Stadium der Arzneimittelzulassung befindet sich das am weitesten fortgeschrittene PROTAC?
ARV-110
Für die Behandlung der metastasierungsresistenten Prostatakrebs (mCRPC) von Männern wurde der PROTAC-Degrader ARV-110 entwickelt, das auf den Androgenrezeptor (AR) abzielt.
Die Wirksamkeit der aktuell bestehenden Inhibitoren Enzalutamid und Abirateron werden durch Resistenzmechanismen wie z.B. erhöhte AR-Produktion, Mutationen verringert. Zudem sprechen 15 – 25 % der Patienten nicht auf die Behandlung an.
Abgeleitet von Enzalutamid wurde 2018 von dem PROTAC-Degrader ARCC-4 (DC50 = 5 nM) berichtet. Das Unternehmen Arvinas entwickelte einen weiteren Degrader, das ARV-110.
Dieser erwies sich als hoch selektiv und zeigte ein DC50 – Wert von 1 nM.
In präklinischen Studien erwies sich ARV-110 mit dem Abbau des AR-Proteins als sehr vielversprechend (in vivo-Modelle zeigten 70 bzw. 100 % Tumorwachstumshemmung). Derzeit befindet sich der Degrader in der ersten Phase der klinischen Studie und wird bei Männern mit mCRPC untersucht, die Fortschritte bei den Standardbehandlungen gezeigt hatten. Beginn der Studie: März 2019, orale Therapie.
Wie sehen PROTACS strukturell aus?
Beispiel: PROTAC-Degrader des SHP2-Proteins
