Gruppe 2: Drug Induced Liver Injury (DILI) Flashcards
Definieren Sie DILI
Von was hängt es ab?
Wie schnell tritt es auf?
Beispiel?
DILI = Drug Induced Liver Injury, auch intrinsic Drug Induced Liver Injury
Dosisabhängige, innerhalb von Tagen nach Beginn der Therapie eintretende Leberschädigung, die über einer gewissen Schwellendosis vorhersehbar auftritt.
Bsp.: Lebertoxizität von Paracetamol
Definieren Sie iDILI!
Von was hängt es ab?
Wie schnell tritt es auf?
Was ist die Folge hiervon?
iDILI = Idiosyncratic Drug Induced Liver Injury
Dosisunabhängige, kaum berechenbare, seltene Schädigung der Leber in prädestinierten Patienten, welche unvorhersehbar und meist nur im Menschen, nicht im Tierversuch auftritt. (Inzidenz < 1 Patient von 10 000)
Oft ist das Immunsystem an der Schädigung beteiligt, die Manifestation tritt verzögert, erst Wochen oder Monate nach Beginn der Therapie auf, als Risikofaktor gelten einige Genotypen im HLA (human leucocyte antigen) Gen.
iDILI ist ein häufiger Grund für das Scheitern neuer Arzneistoffkandidaten in klinischen Studien.
Beschreiben Sie die Funktion des BSEP
BSEP = Bile Salt Export Pump
ATP-abhängiges Membran-Transportprotein in der apikalen Membran von Hepatozyten das den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Gallensäure Exkretion darstellt. Deswegen ist der BSEP essenziell für den normalen Gallenfluss.
Welche konkreten Folgen sind bei einer Störung/Hemmung des BSEP für den Patienten zu erwarten?
Symptome?
Eine Hemmung des BSEP führt zu einem gestörten Gallenfluss (Cholestase), weil die Gallensalze in den Hepatozyten akkumulieren und weniger in die Gallenblase abgegeben werden.
Der Körper kann teilweise auf andere Transporter zurückgreifen und diese hoch regulieren, um die Gallensalze aus den Hepatozyten zu entfernen. Es kommt zu einer Ansammlung von Gallenflüssigkeit in der Leber (=Cholestase).
Symptome können erhöhte Leberenzyme im Blut, Vitaminmangel, Ikterus, Juckreiz am ganzen Körper, Diarrhoe oder Gewichtsverlust sein.
Beschreiben Sie ein Testsystem zur Untersuchung der Inhibition des BSEP
In vitro Methode
- Insektenzelllinien mit Baculovirus infizierten
- Insektenzellen exprimieren BSEP auf Vesikel
- > Exprimieren entweder in das Vesikel rein oder raus
- > Brauche nur die Vesikel mit den BSEP die in das Vesikel rein pumpen - AMP-haltiges statt ATP-haltiges Medium verwenden um ATP unabhängigen Transport zu simulieren.
- Teste Aufnahme einer Gallensäure in Anwesenheit und Abwesenheit der Testsubstanz
- Verglichen mit der Aufnahme in Kontrollvesikel ohne BSEP.
- Substrattransport wird durch ein Radiolabel, Fluoreszenz oder LC-MS verfolgt bzw. gemessen.
Welches Substrat wird für das Testsystem der BSEP Inhibition verwendet?
In welchem Bereich wird der Versuch durchgeführt? (Bezogen auf KM)?
Was wird für eine positive Kontrolle verwendet?
Kompetitive/Nichtkompetitive Inhibition?
Häufigstes Substrat Taurocholat (TCA)
Der Versuch sollte im linearen Bereich der Probenkonzentration durchgeführt werden, bevorzugt unter KM.
Bekannte Inhibitoren (Troglitazon, Pioglitazon, Ritonavir, Cyclosporin) werden für eine positiv-Kontrolle verwendet.
Typischerweise wird eine kompetitive Hemmung vorausgesetzt und die Inhibition nur für eine Konzentration untersucht. Es gibt aber auch nichtkompetitive BSEP Inhibition. Daher sollte, wenn eine vollständigere DILI-Risiko Untersuchung verlangt wird, die Art der Inhibition untersucht werden. Nachteile sind, dass eine mögliche Inhibition durch Metabolite nicht erfasst wird und die Beeinflussung zwischen BSEP und anderen Gallensäure-Transportern in Hepatozyten nicht untersucht werden kann. Daher sind falsch positive und falsch negative Resultate möglich.
Erläutern Sie die Bedeutung von Ritonavir in der HIV-Therapie
- Ritonavir inhibiert HIV-1 und HIV-2-Aspartylprotease. Durch die Hemmung kann das gag-pol-_Polyprotein nicht mehr verarbeiten_ und es entstehen unreife HIV-Partikel, die keinen Infektionskreislauf beginnen können.
- Booster für HIV-Therapeutika, inhibiert CYP2D6 und CYP3A4.
- > Als CYP3A4 Inhibitor verbessert es die Pharmakokinetik anderer Proteaseinhibitoren, wie Lopinavir, dadurch, dass die Inaktivierung von Lopinavir inhibiert wird. Die CYP3A4 Inhibition gilt normalerweise als unerwünschte Arzneimittelwirkung, wird im Zuge einer HAART (highly active antiretroviral therapy) therapeutisch genutzt.
Aus der Publikation ist zu sehen, dass Ritonavir ein größeres DILI-Potential besitzt (BSEP-Inhibition) als Saquinavir. Wie erklären die Autoren diesen Unterschied?
Potentere BSEP Inhibitoren sind:
- Größere Peptidomimetika
- Haben ein höheres Molekulargewicht
- Größere Lipophilie
- Größere TPSA (Total Polar Surface Area)
- Größere Anzahl an Heteroatomen
Diese physikochemischen Eigenschaften korrelieren mit dem Ausmaß des DILI-Potentials aufgrund der BSEP-Inhibition. Dies zeigt sich darin, dass der IC50 von Ritonavir etwas niedriger ist als der von Saquinavir.
Die Klassifizierung von Ritonavir als Most Dili Concern Drug liegt aber auch daran, dass es auch über andere Mechanismen DILI verursacht.
Ritonavir ist auch ein OXPHOS-Inhibitor, Saquinavir nicht. Versuchen Sie diesen Sachverhalt zu erläutern.
- Die Enzyme der oxidativen Phosphorylierung sind in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert. Um diese hemmen zu können, muss ein Stoff in der Lage sein dorthin zu gelangen, hierzu ist eine hohe Lipophilie nötig. Mit einem cLogP von 5.22 ist Ritonavir wesentlich lipophiler, als Saquinavir, außerdem besitzt es eine geringere TPSA.
- OXPHOS Inhibitoren besitzen häufig viele aromatische Ringe und einen geringeren Anteil an sp3-hybridisierten Atomen.
- > Beide Bedingungen treffen auf den Vergleich von Ritonavir und Saquinavir zu.
- Im Vergleich der Strukturformeln von OXPHOS Inhibitoren und Saquinavir fällt auf, dass viele Inhibitoren einen elektronenreichen 5-Ring aufweisen, welcher bei Saquinavir nicht zu finden ist.
Es ist aber auch zu erkennen, dass es kein gemeinsames Pharmacophor unter den OXPHOS Inhibitoren gibt, wodurch nur durch in vitro Modelle oder klinische Studien erkannt werden kann, ob es sich bei der Substanz um einen OXPHOS Inhibitor handelt. Umgekehrt kann ein auf den ersten Blick ähnlicher Stoff wie Saquinavir sicher, also kein Inhibitor, sein.
Was sind die toxischen Produkte von Diclofenac?
Mitochondriale Schäden (Mitotoxicity)
Diclofenac wird hier beschrieben als Complex-I – und OXPHOS-Inhibitor. Wie ist die Toxizität zu erklären?
Die markierten Stoffe zeigen eine cytotoxische Wirkung auf die Hepatozyten. Diese wird auf Mitotoxizität zurückgeführt, da die ATP Level in den Hepatozyten sinken, bevor andere Marker messbar werden.
Diclofenac wird exzessiv metabolisiert, unterliegt einem hohen first pass Effekt und zirkuliert im enterohepatischen Kreislauf. Dadurch ist die Konzentration in der Leber vermutlich höher als die systemische Konzentration.
Es gibt zwei Theorien, eine besagt, dass die oxidativen Metabolite für die Toxizität verantwortlich sind, die andere begründet die Toxizität in der Bildung eines Acyl-Glucuronids. Diclofenac selbst hat auch eine Mitochondrien-schädigende Wirkung.
Oxidativer Stress kann durch Aktivierung des mitochondrialen Permeabilitätsübergangs (MPT) und Membranrupturen zum Zelltod führen.
Diclofenac und die Metabolite 4-OH-Dic und 5-OH-Dic öffnen die MPT (membrane permeability transition) Pore auch, dadurch wird die oxidative Phosphorylierung entkoppelt, da der Protonengradient an der Mitochondrienmembran durch die Pore neutralisiert wird. Außerdem werden Caspasen freigesetzt. Diese sind die wichtigsten Vermittler der Apoptose. Diphenylamin führt nicht hierzu, weswegen eher die Carbonsäurefunktion als das Grundgerüst für diesen Effekt verantwortlich ist.
Die Toxizität von DicGluA wird dadurch erklärt, dass Acyl-Glucuronide Proteine kovalent modifizieren können und dadurch die Funktion des Proteins einschränken oder eine Immunantwort auslösen. So kann auch eine Bindung an Proteine des Komplex I der Atmungskette diesen inaktivieren.
Mitochondriale Schäden
Valproinsäure kann hepatotoxische Wirkungen zeigen, die mit einer Störung der beta-Oxidation erklärt werden können. Formulieren Sie die Biotoxifizierungsreaktion.
Wie läuft die Beta Oxidation von Fettsäuren ab?
Valproinsäure kann hepatotoxische Wirkungen zeigen, die mit einer Störung der beta-Oxidation erklärt werden können.
Formulieren Sie den Grund für die Hepatotoxizität!
Valproinsäure wird analog den Fettsäuren durch die β-Oxidation, die in den Mitochondrien abläuft, metabolisiert.
Ein Metabolit der Valproinsäure, die ∆4-Valproinsäure, weist eine strukturelle Verwandtschaft zu einem bekannten hepatotoxischen Stoff, der 4-Pentensäure auf.
β-Oxidation der 4-Pentensäure ergibt 3-oxo-4-Pentenoyl-CoA, eine reaktive elektrophile Spezies, die die Ketoacyl-CoA-Thiolase alkyliert. Dieses terminale Enzym der β-Oxidation wird dadurch gehemmt.
Durch die Hemmung der Thiolase, reichern sich die Fettsäuren in der Leber an. Valproinsäure hemmt zusätzlich die Carnitin-Palmitoyl-Transferase I (CPTI). Dadurch können Fettsäuren nicht in die Mitochondrien transportiert werden; demnach können sie auch nicht durch die β-Oxidation abgebaut werden. Dies führt zu einer Anreicherung von Fettsäuren in der Leber à Steatose (Fettleber).
Der COMT-Hemmer Tolcapon ist hepatotoxisch, Entacapon nicht. Erklären Sie!
-> Gegen welche Krankheit werden sie eingesetzt?
Tolcapon und Entacapon sind COMT-Hemmer (Catechol-O-Methyltransferase) und werden in der Therapie von Parkinson eingesetzt.
Die Glucuronidierung des Catechols stellt den Hauptmetaboliten des Tolcapons dar, aber durch Reduktion der Nitrocatechol-Gruppe können ein Anilin oder Acetylanilin ebenfalls als Metaboliten entstehen. Diese können zu einem elektrophilen Chinonimin oxidiert werden, dass in Redoxzyklen eintreten und zu oxidativem Stress führen kann.
Mutationen im UGT1A9 Gen, welches das UDP-Glucuronosyltransferase Isoenzym kodiert, dass für die Glucuronidierung des Tolcapons verantwortlich ist, können möglicherweise für die Hepatotoxizität verantwortlich sein, da dadurch vermindert glucuronidiert wird und vermehrt Chinonimine des alternativen Metabolismus Pfades entstehen.
Entacapon hat auch eine Nitrocatechol-Struktur, ist aber nicht hepatotoxisch wie Tolcapon. Grund dafür ist das hier keine Reduktion der Nitro-Gruppe und anschließende Oxidation zu einem Chinonimin stattfindet.Dazu kommt, dass Tolcapon ein potenter Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung ist, Entacapon jedoch nicht.
Troglitazon ist auch ein OXPHOS-Inhibitor bedingt durch die Bildung eines toxischen Metaboliten. Formulieren Sie!
-> Gegen was eingesetzt?
Troglitazon ist ein Glitazon für die Behandlung des Typ II Diabetes mellitus.
Es ist bekannt, dass sowohl das Chroman- als auch das Thiazolidindion-Ringsystem von Troglitazon durch CYP3A4 reaktive Metabolite (Chinon-Methid- und Thiazolidindion-Ringspaltprodukte) bilden.
In der Abbildung ist zu erkennen, dass ein toxischer Chinonmethid-Metabolit entsteht. Dies wird durch GSH neutralisiert, wenn der GSH-Vorrat aber verbraucht ist, kann das Chinonmethid mit anderen Proteinen, wie z.B. der ATP-Synthase reagieren.
Troglitazone inhibiert die ATP-Synthase der inneren Mitochondrienmembran. Diese nutzt den durch die Atmungskette aufgebauten Protonengradienten, um ADP zu ATP zu phosphorylieren. Vermutlich reagiert das Chinonmethid dabei mit einer Zielstruktur im Komplex der ATP-Synthase. Dadurch kann kein ATP produziert werden und es kommt zur Zellapoptose.
Wie sehen die toxischen Metabolite aus?
Wie kann man diese toxischen Metabolite mittels Trapping Mitteln stabilisieren?
Trapping-Reaktionen:
(a) Chinonimin mit GSH,
(b) Aldehyd mit Methoxylamin oder Semicarbazid,
(c) , Iminiumion Intermediat mit Cyanid
Die Metaboliten, die mit den Trapping-Substanzen reagiert haben, werden durch HPLC getrennt und durch MS/MS identifiziert. Eine Strukturaufklärung ist anhand von Fragmentierungsmustern möglich.
