Vorlesung 1: Nucleinsäurefragmente Flashcards

1
Q

Magic Bullet

Was ist das Ziel?

Wie ist der Aufbau?

A
  • geht nur an Wirkort, keine unbeabsichtigten Schäden
  • Über ZIP-Code (Ligand) Spezifität und Selektivität

Nanopartikel mit PAYLOAD (siRNA),PEG-Hülle und Ligand (Zip-Code, Rezeptor Ligand WW)

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2
Q

Welche Therapeutische Konzepte gibt es?

A
  • Am häufigsten ist der Ansatz “Loss of function.”
    • reduzierte oder keine Aktivtät des Targetproteins
  • Gegenteil: “Gain of function”
    • vorhandene Aktivität erhöhen oder neue Aktivität initiieren
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3
Q

Welchen Einfluss hat die chemische Verbesserung der Basenlabiltät der Nucleinsäure?

A
  • biochemische und metabolische Stabiltät
  • Erkennung durch das angeborene Immunsystem
  • Membrangängigkeit
  • Hybridisierung an komplementären Sequenzen (antisense oder siRNA)
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4
Q

Druggable Proteome

Definition?

A
  • Proteinfraktion (Gruppe von Proteinen):
    • binden small molecules oder Antikörper
    • sind potentielle Drug Targets
    • verknüpft mit einer Erkrankung
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5
Q

wie versieht man die modfizierte mRNA mit Cap-Struktur? (wenn noch nocht bei Snythese passiert)

A

1) mit viralen Enzyme wie Vacchina capping Enzyme: bildet ein Triphosphat
2. )Methylierung mit 2 O’methyltransferase

Verfolgung Reaktion über Radioaktiven Assay (H3 Assay, Nuklid sitzt an der Methylgruppe)

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6
Q

Analytik

Nachweis von modifizierten NA?

A
  1. Verdau von Oligonucleotiden mit Nucleasen
  2. LC-MS/MS zur Quantifizierung
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7
Q

Biodistribution of mRNA polyplexes

Wie untersucht man ob die entwickelten Vacchine an den Wirkort gelangen?

A

mRNA wurde mit langkettigen Kationen (mRNA polyplexes) in verschiedenen Verhältnis gemischt

negative geladene Mischungen sammeln sich in der Milz (Ort der Dendritschen Zellen>Immunantwort)

In dendritischen Zellen Translation der mRNA, Epitope werden exprimiert> Zellen Präsentation der selbstsynthetisierten Epitope den MHC-Komplexen>humorale Immunantwort (AK-Vermittelt)

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8
Q

Herstellung synthetischer mRNA (zur Synthese jedes beliebigen Proteins)

Prinzip?

A

Zutaten:

  • doppelsträngige DNA mit relevanter Sequenz (Gewinnung aus Plasmiden oder PCR)
  • NTPs oder modifizierte NTPS (=XTPs)
  • rekombinantes Enzym T7-RNA-Polymerase

POLYMERASE mit CAP-Struktur > Transkription>modifizierte RNA mit CAP-Struktur

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9
Q

Konzept SNALP (Stable nucleic acid lipid particle)

Wie wird die si-RNA verpackt?

A
  • Hülle: Doppellipidschicht
  • auf der Oberfläche PEGylierung (Verknüpfung mit Polyethylenglycol)
    • dadurch Verhinderung dass Proteine daran binden bei Zirkulation im Blut
    • und Medikament wird nicht so schnell erkannt & ausgeschieden
  • siRNA im Innern
  • Fusogenic lipid: sorgt für Aufname Endosomen> Ansäuerung zum Lysosomen
  • Freisetzung payload
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10
Q

Zentrales Dogma und Intervention

Wie beeinflusst antisense NA die Proteinbiosynthese?

A
  • stöchimetrische Mengen antisense NA (1 Molekül pro mRNA)
  • ist komplementär zur mRNA
  • Hybridisierung: blockiert einen Bereich der mRNA

>keine Translation

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11
Q

Adjuvant Effekt

Was ist das?

A

Dendritische Zellen bekommen Signal das Immunantwort benötigt

Initiierung durch PAMPs(pathogen associated molecular pattern) und deren Rezeptoren PRRs-Pattern Recognition Receptors (zB Toll-like-Rezeptoren, relevant für uns TLR 7 &8)

TLRs erkennen nackte nicht modifizierte RNAs > Ausdifferenzierung in Reife der Dendritischen Zellen>reife Zellen Immunstimulation

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12
Q

Konzept der Krebsvacchine

Wie werden Vacchine entwickelt?

A
  • In Maus werden Tumorzellen implantiert
  • Nach Wachstum der Tumore Extraktion>DNA oder RNA Sequenzierung>
  • Identifizierung der Mutationen in den Tumoren
  • Test welche der Isolierten Mutationen als Effektoren einer Immunantwort funktionieren
  • Codierung als mRNA und Anhängen an Peptid
  • Injektion in Maus, Test ob Immunantwort
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13
Q

Welche Nucleinsäuren wirken als Agonisten?

A
  • produzieren mehr Proteine mit mehr Funktion oder relative neuer Funktion
    • mRNA
    • antagomir
  • Effekt des doppelt negativen: miRNA sinkt Proteinanzahl, dieser Effekte wird durch antagomir aufgehoben
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14
Q

Humanes Genom

Wieviel Chromosomenpaare?

Wieiviel Nukleotide?

Wieviel Protein codierende Gene?

A

23 Chromosomenpaare

3*109 Nukleotide

ca. 20 000 Protein codierende Gene (<2%!)

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15
Q

siRNA (small interference RNA)

siRNA dient der Regulierung Genxpression,darum Ansatz Zuführung synthetischer siRNA

Wie entstehen natürliche siRNA?

Wirkungsweise?

Was passiert wenn RISC-Komplex mit miRNA beladen wird?

A
  • lange doppelsträngige RNAs (Alarmsignale in der Zelle)>durch DICER>Zerkleinerung in siRNA(19-23bp) mit vollständiger Basenpaarung
  • Bildung RISC Komplex mit siRNA oder miRNA
  • Komplex mit miRNA: Suche nach Basenpaarung >findet downstream target mRNA >Stop Translation
  • Komplex mit siRNA:findet komplementäre Sequenz einer Target mRNA>RNase Aktivität des RISC-Komplexes zerschneidet mRNA>mRNA Degradierung und Gene silencing
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16
Q

antagomire

Wirkungsweise?

A

über antisense effect wird die miRNA aus dem RISC Komplex abgefangen da antagomire komplementär sind

die Translationsrepression würde wieder aufgehoben werden

17
Q

Wie werden small molecules drugs genannt die:

a) einen Loss of function Effekt haben?
b) einen Gain of function Effekt haben?

A

a) Inhibitoren oder Antagonisten
b) Aktivator oder Agonisten

18
Q

Wie funktioniert LC-MS/MS?

A

reversed phase HPLC zum Auftrennen der Nucleoside aus RNA

Heraussuchen der Phase die von Interesse und noch während Eluation ESI

Analyse durch Triple Quadrupol über elektrische Felder

19
Q

Exon-skipping

Was ist Exon-skipping?

A
  • Beispiel:Erberkrankung spinal muscular atrophy:defektes Gen mit Stopmutationscodon (Exon 4)
  • Exons werden eingspliced aber ab dieser Stelle keine Translation
  • Therapeutischer Ansatz: Injektion antisense- Oligonukleotid
  • “verdecken” Mutiertes Stopcodon (keine Erkennung)> kein Splicing dieses Exons
  • Exon 3 und 5 hintereinander>funktionelles Protein das Pathogenese unterdrückt
20
Q

Wie kann die Basenlabiltät der Nucleinsäuren verbessert werden?

A

Einbau von

  • Phosphothioate (bessere Abschirmung gegen nucleophile Angriffe)
  • 2’O-methyl (zum Entschärfen eines potentiellen Nucleophils)
  • 2’Fluoro(zum Entschärfen eines potentiellen Nucleophils)
  • LNA (locked NA): EInbau Methylengruppe, verknüpft mit 4’Position (Stabilisierung der Basenpaarung der Nucleotide durch Beeinflüssung des Konformation des Zuckers zusätzlich Hydrolyseschutz)
  • 2-Fluoro-arabino (Antieffektiva wie bei Virostatika)
21
Q

Exon-skipping

Was ist ein Exon?

Was ist Exon-skipping?

A
  • Exon: der Teil des Gens der beim Splicing den Kern verlässt
  • wird aus pre-RNA in die mRNA eingebaut
22
Q

Wie ist ein Tripel Quad aufgebaut?

Wie können bei der LC-MS/MS spezifisch Fragmente durchgelassen werden?

A
  • nach Ionisation Nucleoside um eine Masseneinheit schwerer
  • Q1:Gate=nur bestimmte Ionen werden durchgelassen, Einstellung über Polarität der 4 Dipole durch Veränderung Wechselstromfrequenz
  • Q2: collision chamber=Kollision Ionen mit Gas > Fragmentierungsreaktionen (Bruch der Glykosidischen Bindung)
  • Abtrennung der Ribose, Nucleobase trägt posetive Ladung
  • gelangt in Q3 und in Detektor
23
Q

Wieviel Gene sind mit Krankheitsbilder verknüpft?

Wieviele könnten als Targets dienen?

A
  • von bekannten 20 000 Genen stehen experimentell nachgewiesen 4000 im Zusammenhang mit Erkrankungen
  • ein Drittel (1330) kommen als potentielle Targets in Frage
24
Q

RNAi

Wofür steht diese Abkürzung?

A

RNA inteference mittels siRNA oder miRNA

25
Q

Synthese von modifizierten NAs

Welches Verfahren wird verwendet?

A

Phosphoamidit -Verfahren (siehe OC5 Kapitel 2)

26
Q

Wieviele Proteine können mit Wirkstoffen adressiert werden?

A

etwa 750

DURCH:

70% small molecules drugs

12% Biotech Drugs (basieren auf Nukleinsäuren oder Antikörper)

27
Q

metabolische Stabilität von Nucleinsäuren

Welcher metabolische Abbau der RNA ist relevant?

Wie funktioniert er?

A

RNA: Basenlabil

Base greift OH Gruppe der RNA nucleophil an

  • cyclisches Intermediat
  • Spaltung Zu Zucker (3’Ende) und Neucleotid mit 5’Ende
28
Q

Zentrales Dogma und Intervention

Wie beeinflusst RNAi die Proteinbiosynthese?

A

zellulärer Mechanismus

Enzymkomplex mit katalytischer Aktvität

  • kann mit Nucleinsäure mit der codierenden Sequnzinformation auf mRNA eine Tagetsequenz finden
  • zerschneidet diese katalytisch
29
Q

Aptamere

Defintion?

A
  • Nucleinsäuren mit ausgeprägter 3D-Struktur, binden an bestimmte vorgegebene Liganden
  • Liganden werden generiert durch SELEX (Systematic Evolution of Ligands by exponential enrichment)
  • Funktionsweise mit Antikörper vergleichbar
30
Q

miRNA

Entstehung?

Bewirkt mit RISC?

A
  • aus miRNA precursur >DICER>miRNA (teilweise ohne vollständige Basenpaarung)
  • bildet RISC Komplex
  • Bindung mit RISC an Target mRNA> Translationsrepression
31
Q

siRNA-Medikamente

Formulierung and Targeting

A
  • Problem: “nackte” NA wird über die Niere ausgeschieden
  • Nanopartikel über die Leber

>Entwicklung von Medikamenten die in Cholesterol-Biosynthese eingriffen

>Medikamente gegen Lebertumore

EPR-Effekt in Tumoren (enhanced permeability and retention):Blutgefäße im Tumor schlecht strukturiert (durchlässig mit vielen Löchern)>Nanopartikel im Blutstrom werden herausgefiltert>Anreicherung in löchrige Gefäße

(aber Großteil geht immer noch in die Leber)

32
Q

Welche Nucleinsäuren haben eine antagonistische Wirkung?

A
  • Bewirken eine Reduzierung der Proteinproduktion
    • antisense NA
    • siRNA
    • miRNA