Vorlesung 1: Nucleinsäurefragmente Flashcards
Magic Bullet
Was ist das Ziel?
Wie ist der Aufbau?
- geht nur an Wirkort, keine unbeabsichtigten Schäden
- Über ZIP-Code (Ligand) Spezifität und Selektivität
Nanopartikel mit PAYLOAD (siRNA),PEG-Hülle und Ligand (Zip-Code, Rezeptor Ligand WW)
Welche Therapeutische Konzepte gibt es?
- Am häufigsten ist der Ansatz “Loss of function.”
- reduzierte oder keine Aktivtät des Targetproteins
- Gegenteil: “Gain of function”
- vorhandene Aktivität erhöhen oder neue Aktivität initiieren
Welchen Einfluss hat die chemische Verbesserung der Basenlabiltät der Nucleinsäure?
- biochemische und metabolische Stabiltät
- Erkennung durch das angeborene Immunsystem
- Membrangängigkeit
- Hybridisierung an komplementären Sequenzen (antisense oder siRNA)
Druggable Proteome
Definition?
- Proteinfraktion (Gruppe von Proteinen):
- binden small molecules oder Antikörper
- sind potentielle Drug Targets
- verknüpft mit einer Erkrankung
wie versieht man die modfizierte mRNA mit Cap-Struktur? (wenn noch nocht bei Snythese passiert)
1) mit viralen Enzyme wie Vacchina capping Enzyme: bildet ein Triphosphat
2. )Methylierung mit 2 O’methyltransferase
Verfolgung Reaktion über Radioaktiven Assay (H3 Assay, Nuklid sitzt an der Methylgruppe)
Analytik
Nachweis von modifizierten NA?
- Verdau von Oligonucleotiden mit Nucleasen
- LC-MS/MS zur Quantifizierung
Biodistribution of mRNA polyplexes
Wie untersucht man ob die entwickelten Vacchine an den Wirkort gelangen?
mRNA wurde mit langkettigen Kationen (mRNA polyplexes) in verschiedenen Verhältnis gemischt
negative geladene Mischungen sammeln sich in der Milz (Ort der Dendritschen Zellen>Immunantwort)
In dendritischen Zellen Translation der mRNA, Epitope werden exprimiert> Zellen Präsentation der selbstsynthetisierten Epitope den MHC-Komplexen>humorale Immunantwort (AK-Vermittelt)
Herstellung synthetischer mRNA (zur Synthese jedes beliebigen Proteins)
Prinzip?
Zutaten:
- doppelsträngige DNA mit relevanter Sequenz (Gewinnung aus Plasmiden oder PCR)
- NTPs oder modifizierte NTPS (=XTPs)
- rekombinantes Enzym T7-RNA-Polymerase
POLYMERASE mit CAP-Struktur > Transkription>modifizierte RNA mit CAP-Struktur
Konzept SNALP (Stable nucleic acid lipid particle)
Wie wird die si-RNA verpackt?
- Hülle: Doppellipidschicht
- auf der Oberfläche PEGylierung (Verknüpfung mit Polyethylenglycol)
- dadurch Verhinderung dass Proteine daran binden bei Zirkulation im Blut
- und Medikament wird nicht so schnell erkannt & ausgeschieden
- siRNA im Innern
- Fusogenic lipid: sorgt für Aufname Endosomen> Ansäuerung zum Lysosomen
- Freisetzung payload
Zentrales Dogma und Intervention
Wie beeinflusst antisense NA die Proteinbiosynthese?
- stöchimetrische Mengen antisense NA (1 Molekül pro mRNA)
- ist komplementär zur mRNA
- Hybridisierung: blockiert einen Bereich der mRNA
>keine Translation
Adjuvant Effekt
Was ist das?
Dendritische Zellen bekommen Signal das Immunantwort benötigt
Initiierung durch PAMPs(pathogen associated molecular pattern) und deren Rezeptoren PRRs-Pattern Recognition Receptors (zB Toll-like-Rezeptoren, relevant für uns TLR 7 &8)
TLRs erkennen nackte nicht modifizierte RNAs > Ausdifferenzierung in Reife der Dendritischen Zellen>reife Zellen Immunstimulation
Konzept der Krebsvacchine
Wie werden Vacchine entwickelt?
- In Maus werden Tumorzellen implantiert
- Nach Wachstum der Tumore Extraktion>DNA oder RNA Sequenzierung>
- Identifizierung der Mutationen in den Tumoren
- Test welche der Isolierten Mutationen als Effektoren einer Immunantwort funktionieren
- Codierung als mRNA und Anhängen an Peptid
- Injektion in Maus, Test ob Immunantwort
Welche Nucleinsäuren wirken als Agonisten?
- produzieren mehr Proteine mit mehr Funktion oder relative neuer Funktion
- mRNA
- antagomir
- Effekt des doppelt negativen: miRNA sinkt Proteinanzahl, dieser Effekte wird durch antagomir aufgehoben
Humanes Genom
Wieviel Chromosomenpaare?
Wieiviel Nukleotide?
Wieviel Protein codierende Gene?
23 Chromosomenpaare
3*109 Nukleotide
ca. 20 000 Protein codierende Gene (<2%!)
siRNA (small interference RNA)
siRNA dient der Regulierung Genxpression,darum Ansatz Zuführung synthetischer siRNA
Wie entstehen natürliche siRNA?
Wirkungsweise?
Was passiert wenn RISC-Komplex mit miRNA beladen wird?
- lange doppelsträngige RNAs (Alarmsignale in der Zelle)>durch DICER>Zerkleinerung in siRNA(19-23bp) mit vollständiger Basenpaarung
- Bildung RISC Komplex mit siRNA oder miRNA
- Komplex mit miRNA: Suche nach Basenpaarung >findet downstream target mRNA >Stop Translation
- Komplex mit siRNA:findet komplementäre Sequenz einer Target mRNA>RNase Aktivität des RISC-Komplexes zerschneidet mRNA>mRNA Degradierung und Gene silencing
antagomire
Wirkungsweise?
über antisense effect wird die miRNA aus dem RISC Komplex abgefangen da antagomire komplementär sind
die Translationsrepression würde wieder aufgehoben werden
Wie werden small molecules drugs genannt die:
a) einen Loss of function Effekt haben?
b) einen Gain of function Effekt haben?
a) Inhibitoren oder Antagonisten
b) Aktivator oder Agonisten
Wie funktioniert LC-MS/MS?
reversed phase HPLC zum Auftrennen der Nucleoside aus RNA
Heraussuchen der Phase die von Interesse und noch während Eluation ESI
Analyse durch Triple Quadrupol über elektrische Felder
Exon-skipping
Was ist Exon-skipping?
- Beispiel:Erberkrankung spinal muscular atrophy:defektes Gen mit Stopmutationscodon (Exon 4)
- Exons werden eingspliced aber ab dieser Stelle keine Translation
- Therapeutischer Ansatz: Injektion antisense- Oligonukleotid
- “verdecken” Mutiertes Stopcodon (keine Erkennung)> kein Splicing dieses Exons
- Exon 3 und 5 hintereinander>funktionelles Protein das Pathogenese unterdrückt
Wie kann die Basenlabiltät der Nucleinsäuren verbessert werden?
Einbau von
- Phosphothioate (bessere Abschirmung gegen nucleophile Angriffe)
- 2’O-methyl (zum Entschärfen eines potentiellen Nucleophils)
- 2’Fluoro(zum Entschärfen eines potentiellen Nucleophils)
- LNA (locked NA): EInbau Methylengruppe, verknüpft mit 4’Position (Stabilisierung der Basenpaarung der Nucleotide durch Beeinflüssung des Konformation des Zuckers zusätzlich Hydrolyseschutz)
- 2-Fluoro-arabino (Antieffektiva wie bei Virostatika)
Exon-skipping
Was ist ein Exon?
Was ist Exon-skipping?
- Exon: der Teil des Gens der beim Splicing den Kern verlässt
- wird aus pre-RNA in die mRNA eingebaut
Wie ist ein Tripel Quad aufgebaut?
Wie können bei der LC-MS/MS spezifisch Fragmente durchgelassen werden?
- nach Ionisation Nucleoside um eine Masseneinheit schwerer
- Q1:Gate=nur bestimmte Ionen werden durchgelassen, Einstellung über Polarität der 4 Dipole durch Veränderung Wechselstromfrequenz
- Q2: collision chamber=Kollision Ionen mit Gas > Fragmentierungsreaktionen (Bruch der Glykosidischen Bindung)
- Abtrennung der Ribose, Nucleobase trägt posetive Ladung
- gelangt in Q3 und in Detektor
Wieviel Gene sind mit Krankheitsbilder verknüpft?
Wieviele könnten als Targets dienen?
- von bekannten 20 000 Genen stehen experimentell nachgewiesen 4000 im Zusammenhang mit Erkrankungen
- ein Drittel (1330) kommen als potentielle Targets in Frage
RNAi
Wofür steht diese Abkürzung?
RNA inteference mittels siRNA oder miRNA
Synthese von modifizierten NAs
Welches Verfahren wird verwendet?
Phosphoamidit -Verfahren (siehe OC5 Kapitel 2)
Wieviele Proteine können mit Wirkstoffen adressiert werden?
etwa 750
DURCH:
70% small molecules drugs
12% Biotech Drugs (basieren auf Nukleinsäuren oder Antikörper)
metabolische Stabilität von Nucleinsäuren
Welcher metabolische Abbau der RNA ist relevant?
Wie funktioniert er?
RNA: Basenlabil
Base greift OH Gruppe der RNA nucleophil an
- cyclisches Intermediat
- Spaltung Zu Zucker (3’Ende) und Neucleotid mit 5’Ende
Zentrales Dogma und Intervention
Wie beeinflusst RNAi die Proteinbiosynthese?
zellulärer Mechanismus
Enzymkomplex mit katalytischer Aktvität
- kann mit Nucleinsäure mit der codierenden Sequnzinformation auf mRNA eine Tagetsequenz finden
- zerschneidet diese katalytisch
Aptamere
Defintion?
- Nucleinsäuren mit ausgeprägter 3D-Struktur, binden an bestimmte vorgegebene Liganden
- Liganden werden generiert durch SELEX (Systematic Evolution of Ligands by exponential enrichment)
- Funktionsweise mit Antikörper vergleichbar
miRNA
Entstehung?
Bewirkt mit RISC?
- aus miRNA precursur >DICER>miRNA (teilweise ohne vollständige Basenpaarung)
- bildet RISC Komplex
- Bindung mit RISC an Target mRNA> Translationsrepression
siRNA-Medikamente
Formulierung and Targeting
- Problem: “nackte” NA wird über die Niere ausgeschieden
- Nanopartikel über die Leber
>Entwicklung von Medikamenten die in Cholesterol-Biosynthese eingriffen
>Medikamente gegen Lebertumore
EPR-Effekt in Tumoren (enhanced permeability and retention):Blutgefäße im Tumor schlecht strukturiert (durchlässig mit vielen Löchern)>Nanopartikel im Blutstrom werden herausgefiltert>Anreicherung in löchrige Gefäße
(aber Großteil geht immer noch in die Leber)
Welche Nucleinsäuren haben eine antagonistische Wirkung?
- Bewirken eine Reduzierung der Proteinproduktion
- antisense NA
- siRNA
- miRNA
