Vorlesung 3: Screening & Bio(phys)assays II

Question 1

Was macht man bei einem His-tag?

Answer 1

Säule besitzt Nickel und kann mit Polyhistidin tag wechselwirken

Mit Imidazol eluieren

-> Proteine an Säule binden

Question 2

Target mit einem Fluoreszenzfarbstoff markieren über NHS Ester

-> Wie funktioniert das?

Answer 2

Question 3

Maleinimid zur Markierung eines Proteins mit einem Fluoreszenzfarbstoff

Answer 3

Michael Addition

-> Aber Aufpassen wenn Schwefel im aktiven Zentrum ist

Question 4

Wie ist eine SPR (Surface Plasmon Resonance) Messung aufgebaut und wie wird sie durchgeführt?

Answer 4

1. Zielmolekül auf der Gold-beschichteten Oberfläche eines Chips verankert
2. Registrierung von Änderungen des Brechungsindex an der Oberfläche des Chips
   durch Registrierung der Verschiebung des Winkels der Totalreflexion
   = Maß für Massenänderung auf Sensoroberfläche

Question 6

Wie lässt sich das Ergebnis einer SPR Messung darstellen?

Answer 6

Unten: Änderung der Response (Brechungsindex) mit der Zeit, verursacht durch die Bindung des Liganden

Oben: Brechungsindex hat eine Winkel Komponente die bei der Bindung eines Liganden verändert wird

-> Trage Response (Brechungsindex) gegen Winkel auf und stelle eine Verschiebung fest

Question 7

Bei der SPR Messung wird der Brechungsindex (Resonance Signal; RU) bei verschiedenen Konzentrationen gemessen und gegen die Zeit aufgetragen.

Wie wird daraus K_d bestimmt?

Answer 7

Wähle eine bestimmte Zeit aus, nach der RU mit anderen Konzentrationen verglichen werden soll.

• > Erhalte RU gegen Konzentration
• > Erhalte K_d

Question 9

Die BLI ähnelt der SPR

Wofür steht die Abkürzung?

Was ist der Unterschied zu SPR?

Wie wird das gemacht?

Answer 9

BLI: Bio-Layer Interferometrie

Interferenz wird gemessen und nicht der Brechungswinkel

1. Messe Licht durch eine Referenzsubstanz ohne Probe
2. Messe Licht der Probe
   - > Erhalte Interferenz (Delta Lambda)

Question 10

Wie funktionieren switchSENSE dynamic biosensors?

Answer 10

1. Ligand und einsträngige DNA werden verknüpft
2. Diese einsträngige DNA wird mit komplementärer DNA verbunden, die auf einer Platte befestigt wurde und ein Fluoreszenz Molekül trägt
3. Beginne Wechselstrom fließen zu lassen (DNA ist negativ geladen) und wird zur Platte hin und wieder zurück bewegt. (Fluorophor kommt dabei der Platte nahe)
4. Platte trägt Quencher und kann Fluoreszen unterdrücken
5. Gebe Protein hinzu -> Bewegungsverhalten der DNA ändert sich -> Fluoreszenz ändert sich

Question 12

Wie läuft das MST-Screening ab?

Answer 12

1. Messe Fluoreszenz am Anfang
2. Probe mit IR-Laser bestrahlen
3. Temperatur in der Mitte der Platte steigt an
   - > Moleküle diffundieren an den Rand der Platte (Thermophorese-Effekt)
   - > Gemessene Fluoreszenz nimmt ab
4. Laser aus -> Platte kühlt ab -> Moleküle wandern wieder in die Mitte der Platte
5. Führe selbe Schritte mit anderen Konzentrationen durch
6. Auswertung: Fluoreszenz korreliert mit Substratkonzentration korreliert mit Wandergeschwindigkeit korreliert mit Bindungsereignis (Enzym + Ligand) hervorgerufene Veränderung der Größe, Ladung und Hydrathülle (durch Änderung der Solvatationsentropie)

Question 13

Was trägt man beim MST-Screening auf? (Ergebnis)

Answer 13

Auftragung der normierten Fluoreszenzänderung ΔFnorm (als Verhältnis der Fluoreszenz nach gewisser MST-on-time und der Fluoreszenz vor Aktivierung des IR-Lasers) gegen die Ligandenkonzentration

-> Sigmoidale Dosis-Wirkungskurve erhalten, aus welcher durch Fitten die Dissoziations-konstante K_D, ergo die Bindungsaffinität bestimmt werden kann.

Question 15

Wie funtioniert die pH-stat-Methode am Beispiel von AChE?

Was will man damit messen?

Answer 15

Messe die Aktivität des Enzyms bei konstantem pH-Wert

Bei der Reaktion sinkt der pH-Wert (H⁺), deshalb erfolgt permanent eine Titration mit NaOH-Maßlösung um diesen bei 7.5 zu halten

Question 16

Welche Methode existiert neben der pH-stat-Methode noch zur Aktivitätsbestimmung der Acetylcholinesterase?

Wie heißt das dabei verwendete Substrat?

Wie heißt das Reagenz?

Was wird wo nachgewiesen?

(Reaktionsgleichung unwichtig)

Answer 16

Acetylthiocholin (Ist ein Thioester -> Also instabil)

Wenn es zur Spaltung kommt erhält man eine Thiol Gruppe.

Diese kann mit Ellman‘s Reagenz (DTNB) zu TNB umgesetzt und bei 412 nm nachgewiesen werden

Question 17

Wie kann die Protease Aktivität mit einem Assay bestimmt werden?

(Tipp: Die Aminosäure neben der Stelle an der das Peptid gespalten wird ist nicht wichtig für die Protease Aktivität)

Answer 17

Einführung von Nitroanilin/Nitrophenol welches bei 405 nm nachgewiesen werden kann

Oder Einführung eines Amino-cumarin-Derivats welches ebenfalls Fluoresziert und dann nachgewiesen werden kann

Question 18

Wie kann die Protease Aktivität mit einem Assay bestimmt werden?

(Tipp: Die Aminosäure neben der Stelle an der das Peptid gespalten wird ist für die Protease Aktivität wichtig!)

Answer 18

FRET System verwenden

So lange sich Fluorophor und Quencher nahe genug zueinander befinden wird das Lichtsignal “gequenched”

Bei der Spaltung durch eine Protease werden die beiden Komponenten voneinander getrennt -> Erhalte Lichtsignal

Question 19

Wofür eignet sich die SPR Messung besonders gut?

Answer 19

Zum bestimmen von Bindungskinetiken!

Question 20

Was ist ein Dark Quencher?

Vergleiche das mit einem normalen Quencher

Answer 20

Normal: Fluorophor absorbiert Strahlung bei 488 nm

Hat eine Emission bei 619 nm

Quencher Absorbiert diese Strahlung bei 619 nm (Spectral Overlap)

Hat eine Emission bei 660 nm

Dark Quencher: Hat keine Emission bei 660 nm, sondern emittiert keine Strahlung

Question 21

Wofür werden EDANS und Dabcyl verwendet?

Answer 21

Für FRET

Question 22

Bevor ein Medikament an lebenden Organismen getestet wird, muss es an einer Zellkultur getestet werden -> Testung auf Cytotoxizität

Dafür wird MTA verwendet, wofür steht diese Abkürzung?

Was passiert hierbei?

Auf welches Molekül wird hierbei getestet?

Answer 22

MTA: Microculture tetrazolium assays

Reduktion von Tetrazoliumsalzen zu Formazanen

Succinat-Dehydrogenase führt diese Reduktion aus

Question 23

Was sind neben TTC Stoffe mit denen auf Cytotoxizität getestet werden kann?

Zu was werden diese Stoffe jeweils reduziert?

Answer 23

MTT (zellgängig)

XTT / WST-8 (nicht zellgängig -> Reduktion an der Plasmamembran)

Werden beide zu Formazan reduziert

Question 24

Tetrazolium ist in vielen Strukturen enthalten wie heißt das Produkt der Reduktion?

Reaktionsgleichung!

Answer 24

Question 26

Zeige die Reaktion von Lactat zu Pyruvat.

Was ist das Enzym?

Welcher Cofaktor ist von Bedeutung?

Answer 26

Question 28

Wie ist Ki definiert?

Wie ist die residence time definiert?

Wie ist die HWZ (Halbwertszeit) des Komplexes definiert?

Answer 28

Ki = k_off / k_on

residence time = 1 / k_off

t_1/2 = ln2/k = 0,693/k (Einsetzen von residence time) -> 0,693*residence time

Question 29

Optischer Test

Bei welcher Wellenlänge wird gemessen und warum?

Answer 29

NAD⁺ 260nm

NADH 340nm

Größeres delokalisiertes pi-Elektronensystem -> Bathochrome Verschiebung (längerwellig, weniger Energie)

Question 30

Optischer Test

Wie sehen die Moleküle aus die dafür wichtig sind?

Answer 30

Question 31

Optischer Test

Extinktionsdiagramm

Answer 31

Question 32

Was kann mit dem Resazurin Test nachgewiesen werden?

Wie funktioniert das?

Was für zwei Varianten existieren?

Answer 32

Weiße LDH Aktivität nach -> Bildet NADH welches Resazurin zu Resorufin in Gegenwart von Diaphorase umwandelt -> Diaphorase sendet Lichtsignal aus

LDH kann entweder in der Zelle sein (Test auf lebende Zellen) oder im Zytoplasma (Cytotoxischer Assay)

-> Bei Cytotoxischem Assay ist das Signal außerhalb der Zelle viel größer als in der Zelle -> Deshalb kein Problem beim Nachweis

Question 35

Wofür steht MST?

Was ist der Thermophorese-Effekt?

Answer 35

MST: Microscale Thermophoresis

Thermophorese-Effekt: Als Thermophorese, Thermodiffusion oder Ludwig-Soret-Effekt wird in den Naturwissenschaften die Bewegung von Teilchen aufgrund eines Temperaturgradienten innerhalb eines Fluids bezeichnet.

Question 38

Kann man mit MST Bindungskinetiken bestimmen?

Answer 38

Nein!

Question 43

FRET

Wofür steht die Abkürzung?

Welcher Abstand zwischen Donor und Akzeptor sollte maximal bestehen?

Warum ist der Abstand so wichtig?

Answer 43

Förster resonance energy transfer

Abstand zw. Donor und Quencher ca. 35 - 85 Å

Abstand der Moleküle r geht in 6. Potenz in die Effizienz ein mit der das Lichtsignal gequenched wird

Bei zu großem Abstand -> Kein quenchen möglich

Question 49

Welcher Stoff kann verwendet werden um bei geschädigten Zellen anzufärben?

-> Worauf muss man achten?

Welcher Stoff kann verwendet werden um nur lebende Zellen anzufärben?

Answer 49

Anfärbung mit Trypanblau : nur bei geschädigten Zellen kann der Farbstoff ins Cytoplasma eindringen (Messung der Schädigung von Zellmembranen Vitalfärbung) Vorsicht ist selbst cytotoxisch!! Schnell arbeiten!

Anfärbung mit Neutralrot (neutral red): nur lebende Zellen können Neutralrot in die Lysosomen (pH ca. 4-5) aufnehmen

Question 51

Was kann man mit dem Test auf LDH aussagen?

Answer 51

LDH in vitalen Zellen im Cytoplasma, Schädigung der Zellmembran

• > Freisetzung cytoplasmatischer Bestandteile
• > Anreicherung von LDH im Medium (Überstand)

Question 52

Optischer Test

Wie lautet die vereinfachte Reaktionsgleichung?

Welches ist das chromophore System?

Answer 52

NAD⁺ + H⁺+2e^- -> NADH

Nicotinamid ist chromophores System