Vorlesung 3: Screening & Bio(phys)assays II Flashcards
Was macht man bei einem His-tag?
Säule besitzt Nickel und kann mit Polyhistidin tag wechselwirken
Mit Imidazol eluieren
-> Proteine an Säule binden
Target mit einem Fluoreszenzfarbstoff markieren über NHS Ester
-> Wie funktioniert das?
Maleinimid zur Markierung eines Proteins mit einem Fluoreszenzfarbstoff
Michael Addition
-> Aber Aufpassen wenn Schwefel im aktiven Zentrum ist
Wie ist eine SPR (Surface Plasmon Resonance) Messung aufgebaut und wie wird sie durchgeführt?
- Zielmolekül auf der Gold-beschichteten Oberfläche eines Chips verankert
- Registrierung von Änderungen des Brechungsindex an der Oberfläche des Chips
durch Registrierung der Verschiebung des Winkels der Totalreflexion
= Maß für Massenänderung auf Sensoroberfläche
Wie lässt sich das Ergebnis einer SPR Messung darstellen?
Unten: Änderung der Response (Brechungsindex) mit der Zeit, verursacht durch die Bindung des Liganden
Oben: Brechungsindex hat eine Winkel Komponente die bei der Bindung eines Liganden verändert wird
-> Trage Response (Brechungsindex) gegen Winkel auf und stelle eine Verschiebung fest
Bei der SPR Messung wird der Brechungsindex (Resonance Signal; RU) bei verschiedenen Konzentrationen gemessen und gegen die Zeit aufgetragen.
Wie wird daraus Kd bestimmt?
Wähle eine bestimmte Zeit aus, nach der RU mit anderen Konzentrationen verglichen werden soll.
- > Erhalte RU gegen Konzentration
- > Erhalte Kd
Die BLI ähnelt der SPR
Wofür steht die Abkürzung?
Was ist der Unterschied zu SPR?
Wie wird das gemacht?
BLI: Bio-Layer Interferometrie
Interferenz wird gemessen und nicht der Brechungswinkel
- Messe Licht durch eine Referenzsubstanz ohne Probe
- Messe Licht der Probe
- > Erhalte Interferenz (Delta Lambda)
Wie funktionieren switchSENSE dynamic biosensors?
- Ligand und einsträngige DNA werden verknüpft
- Diese einsträngige DNA wird mit komplementärer DNA verbunden, die auf einer Platte befestigt wurde und ein Fluoreszenz Molekül trägt
- Beginne Wechselstrom fließen zu lassen (DNA ist negativ geladen) und wird zur Platte hin und wieder zurück bewegt. (Fluorophor kommt dabei der Platte nahe)
- Platte trägt Quencher und kann Fluoreszen unterdrücken
- Gebe Protein hinzu -> Bewegungsverhalten der DNA ändert sich -> Fluoreszenz ändert sich
Wie läuft das MST-Screening ab?
- Messe Fluoreszenz am Anfang
- Probe mit IR-Laser bestrahlen
- Temperatur in der Mitte der Platte steigt an
- > Moleküle diffundieren an den Rand der Platte (Thermophorese-Effekt)
- > Gemessene Fluoreszenz nimmt ab - Laser aus -> Platte kühlt ab -> Moleküle wandern wieder in die Mitte der Platte
- Führe selbe Schritte mit anderen Konzentrationen durch
- Auswertung: Fluoreszenz korreliert mit Substratkonzentration korreliert mit Wandergeschwindigkeit korreliert mit Bindungsereignis (Enzym + Ligand) hervorgerufene Veränderung der Größe, Ladung und Hydrathülle (durch Änderung der Solvatationsentropie)
Was trägt man beim MST-Screening auf? (Ergebnis)
Auftragung der normierten Fluoreszenzänderung ΔFnorm (als Verhältnis der Fluoreszenz nach gewisser MST-on-time und der Fluoreszenz vor Aktivierung des IR-Lasers) gegen die Ligandenkonzentration
-> Sigmoidale Dosis-Wirkungskurve erhalten, aus welcher durch Fitten die Dissoziations-konstante KD, ergo die Bindungsaffinität bestimmt werden kann.
Wie funtioniert die pH-stat-Methode am Beispiel von AChE?
Was will man damit messen?
Messe die Aktivität des Enzyms bei konstantem pH-Wert
Bei der Reaktion sinkt der pH-Wert (H+), deshalb erfolgt permanent eine Titration mit NaOH-Maßlösung um diesen bei 7.5 zu halten
Welche Methode existiert neben der pH-stat-Methode noch zur Aktivitätsbestimmung der Acetylcholinesterase?
Wie heißt das dabei verwendete Substrat?
Wie heißt das Reagenz?
Was wird wo nachgewiesen?
(Reaktionsgleichung unwichtig)
Acetylthiocholin (Ist ein Thioester -> Also instabil)
Wenn es zur Spaltung kommt erhält man eine Thiol Gruppe.
Diese kann mit Ellman‘s Reagenz (DTNB) zu TNB umgesetzt und bei 412 nm nachgewiesen werden
Wie kann die Protease Aktivität mit einem Assay bestimmt werden?
(Tipp: Die Aminosäure neben der Stelle an der das Peptid gespalten wird ist nicht wichtig für die Protease Aktivität)
Einführung von Nitroanilin/Nitrophenol welches bei 405 nm nachgewiesen werden kann
Oder Einführung eines Amino-cumarin-Derivats welches ebenfalls Fluoresziert und dann nachgewiesen werden kann
Wie kann die Protease Aktivität mit einem Assay bestimmt werden?
(Tipp: Die Aminosäure neben der Stelle an der das Peptid gespalten wird ist für die Protease Aktivität wichtig!)
FRET System verwenden
So lange sich Fluorophor und Quencher nahe genug zueinander befinden wird das Lichtsignal “gequenched”
Bei der Spaltung durch eine Protease werden die beiden Komponenten voneinander getrennt -> Erhalte Lichtsignal
Wofür eignet sich die SPR Messung besonders gut?
Zum bestimmen von Bindungskinetiken!
Was ist ein Dark Quencher?
Vergleiche das mit einem normalen Quencher
Normal: Fluorophor absorbiert Strahlung bei 488 nm
Hat eine Emission bei 619 nm
Quencher Absorbiert diese Strahlung bei 619 nm (Spectral Overlap)
Hat eine Emission bei 660 nm
Dark Quencher: Hat keine Emission bei 660 nm, sondern emittiert keine Strahlung
Wofür werden EDANS und Dabcyl verwendet?
Für FRET
Bevor ein Medikament an lebenden Organismen getestet wird, muss es an einer Zellkultur getestet werden -> Testung auf Cytotoxizität
Dafür wird MTA verwendet, wofür steht diese Abkürzung?
Was passiert hierbei?
Auf welches Molekül wird hierbei getestet?
MTA: Microculture tetrazolium assays
Reduktion von Tetrazoliumsalzen zu Formazanen
Succinat-Dehydrogenase führt diese Reduktion aus
Was sind neben TTC Stoffe mit denen auf Cytotoxizität getestet werden kann?
Zu was werden diese Stoffe jeweils reduziert?
MTT (zellgängig)
XTT / WST-8 (nicht zellgängig -> Reduktion an der Plasmamembran)
Werden beide zu Formazan reduziert
Tetrazolium ist in vielen Strukturen enthalten wie heißt das Produkt der Reduktion?
Reaktionsgleichung!
Zeige die Reaktion von Lactat zu Pyruvat.
Was ist das Enzym?
Welcher Cofaktor ist von Bedeutung?
Wie ist Ki definiert?
Wie ist die residence time definiert?
Wie ist die HWZ (Halbwertszeit) des Komplexes definiert?
Ki = koff / kon
residence time = 1 / koff
t1/2 = ln2/k = 0,693/k (Einsetzen von residence time) -> 0,693*residence time
Optischer Test
Bei welcher Wellenlänge wird gemessen und warum?
NAD+ 260nm
NADH 340nm
Größeres delokalisiertes pi-Elektronensystem -> Bathochrome Verschiebung (längerwellig, weniger Energie)
Optischer Test
Wie sehen die Moleküle aus die dafür wichtig sind?
Optischer Test
Extinktionsdiagramm
Was kann mit dem Resazurin Test nachgewiesen werden?
Wie funktioniert das?
Was für zwei Varianten existieren?
Weiße LDH Aktivität nach -> Bildet NADH welches Resazurin zu Resorufin in Gegenwart von Diaphorase umwandelt -> Diaphorase sendet Lichtsignal aus
LDH kann entweder in der Zelle sein (Test auf lebende Zellen) oder im Zytoplasma (Cytotoxischer Assay)
-> Bei Cytotoxischem Assay ist das Signal außerhalb der Zelle viel größer als in der Zelle -> Deshalb kein Problem beim Nachweis
Wofür steht MST?
Was ist der Thermophorese-Effekt?
MST: Microscale Thermophoresis
Thermophorese-Effekt: Als Thermophorese, Thermodiffusion oder Ludwig-Soret-Effekt wird in den Naturwissenschaften die Bewegung von Teilchen aufgrund eines Temperaturgradienten innerhalb eines Fluids bezeichnet.
Kann man mit MST Bindungskinetiken bestimmen?
Nein!
FRET
Wofür steht die Abkürzung?
Welcher Abstand zwischen Donor und Akzeptor sollte maximal bestehen?
Warum ist der Abstand so wichtig?
Förster resonance energy transfer
Abstand zw. Donor und Quencher ca. 35 - 85 Å
Abstand der Moleküle r geht in 6. Potenz in die Effizienz ein mit der das Lichtsignal gequenched wird
Bei zu großem Abstand -> Kein quenchen möglich
Welcher Stoff kann verwendet werden um bei geschädigten Zellen anzufärben?
-> Worauf muss man achten?
Welcher Stoff kann verwendet werden um nur lebende Zellen anzufärben?
Anfärbung mit Trypanblau : nur bei geschädigten Zellen kann der Farbstoff ins Cytoplasma eindringen (Messung der Schädigung von Zellmembranen Vitalfärbung) Vorsicht ist selbst cytotoxisch!! Schnell arbeiten!
Anfärbung mit Neutralrot (neutral red): nur lebende Zellen können Neutralrot in die Lysosomen (pH ca. 4-5) aufnehmen
Was kann man mit dem Test auf LDH aussagen?
LDH in vitalen Zellen im Cytoplasma, Schädigung der Zellmembran
- > Freisetzung cytoplasmatischer Bestandteile
- > Anreicherung von LDH im Medium (Überstand)
Optischer Test
Wie lautet die vereinfachte Reaktionsgleichung?
Welches ist das chromophore System?
NAD+ + H++2e- -> NADH
Nicotinamid ist chromophores System
