Gruppe 9: Covalent Fragment-Based Approach/Phospholipase A2 Flashcards
Wofür ist Lipoprotein-assozierte Phospholipase A2 ein Marker?
Beispiele?
Wo wird es gebildet?
Was ist das Problem?
Spezifischer Marker für Vaskuläre Entzündungen
- > Besser als CRP oder TNFalpha weil diese nur auf Entzündungen allgemein hinweisen.
- > Herzinfarkt/Schlaganfall
In arteriosklerotischen Plaques von fettbeladenen Schaumzellen gebildet
Kann aus Schaumzellen freigesetzt werden -> Spaltet Phospholipide und produziert damit proentzündliche Zytokine -> Wirkt Proatherogen
Vergleich kovalenter/reversibeler Inhibitor
Vorteile Nachteile?
Vorteile: Längere Wirkdauer, Potenzsteigerung weil durch die Bindung weniger Substanz gebraucht wird.
Nachteile: Kann unspezifisch mit anderen Molekülen Bindungen eingehen
-> “Haptenisierung”: Inhibitor + Protein -> Antigen gebildet was von Immunsystem erkannt werden kann.
Was sind “Warheads”
Wofür kann man sie verwenden?
Eine reaktive Struktur, die an reaktiven Aminosäuren wie Cystein oder Serin im aktiven Zentrum kovalent bindet
-> Wird als Fragment an nicht-kovalent bindende Arzneistoffe addiert, um eine kovalente Bindung zu ermöglichen
Was sind die zwei Methoden zum Design eines kovalent bindenden Wirkstoffs?
A: WS imitiert Intermediat des Enzymsubstrats während seiner Bindung am aktiven Zentrums
B: Addition von Warhead an einem bereits bekannten hoch selektiv aber nicht-kovalent bindenden WS
Wie funktioniert die kovalent-Fragment basierte Methode zur Herstellung eines neuen Wirkstoffs?
- Warhead bindet kovalent
- > Ist Teil eines bekannten affinen wenig selektiven Inhibitors - Erweiterung durch ein Fragment, das affiner und selektiver ist
- Struktur kann erweitert und angepasst werden an Form der Bindetasche bzw. Seitentasche (Erforscht mit Kristallstrukturen)
Bewertung der Selektivität und kovalente Bindung durch Fluoreszenzmarkierung
-> Ergebnis: ein hochpotenter selektiv kovalent bindender WS
Was ist für die Auswahl eines geeigneten Warheads notwendig?
Co-Kristallbildung muss möglich sein
Geben Sie die Idee der kovalent-Fragment basierten Methode zur Findung eines kovalenten Inhibitors der Lipoprotein-assozierte Phospholipase A2 in eigenen Worten kurz wieder.
Wie erfolgt der Nachweis aus Funktion des Inhibitors?
Ziel ist es einen selektiven Inhibitors für LP-PLA2 (Lipoprotein phospholipase A2) zu designen. Die Vorgehensweise nach dem kovalent Fragment basierten Design, ausgehend von einem kovalent bindenden Warhead und die Addition einer selektiveren Struktur, sowie die Optimierung der Struktur an die Räumlichkeit der Bindetasche ermöglicht eine hohe Selektivität. Dies soll die Nachteile einer unspezifischen kovalenten Bindung an potenzielle Wirkorte vermeiden.
(Bindet ein Wirkstoff kovalent nicht selektiv kann es zu starken Nebenwirkungen kommen unter anderem auch zu Haptenisierung.)
Durch die Addition einer fluoreszierenden Substanz an die kovalent selektivbindende Struktur kann die Enzymaktivität der LpPLA2 in vitro und in lebendenZellen charakterisiert werden. Bisher wurde zur Untersuchungder Enzymaktivität aufwändigere Immunoblotting und Immunoflureszenz Methoden verwendet.
Erklären Sie detailliert den Unterschied von kovalent irreversiblen und kovalent reversiblen Inhibitoren (Kinetiken, usw…)
-> Unter Vergleich von Bindung an Zielprotein bzw. andere Proteine
Wie sollte der IC50 Wert bei irreversiblen Inhibitoren idealerweise sein? Warum?
Irreversibel kovalenter Inhibitor besitzt eine reaktive Gruppe
- Bindung an Zielprotein: Pharmakodynamische Wirkung durch dauerhafte Hemmung bis das Enzym neu synthetisiert wird Abbaufragmente des gehemmten Protein können Immunreaktionen auslösen.
Bindet an andere Proteine: Unspezifische Bindung führt zu unerwünschten Nebenwirkungen
Wirkstoffe, die einen kleinen IC50-Wert haben und eine hohe Selektivität gegenüber das Zielprotein, sind potenter und werden in kleineren Mengen verabreicht
-> Reduktion von UAW
Reversibel kovalente Inhibitoren beisitzen ebenfalls eine reaktive Gruppe
Binden an Zielprotein : Lösen sich wieder, möglichst lange Verweilzeit „residence time“
Bindet an andere Proteine: Im Vergleich zu irreversibel kovalent weniger toxisch
Erklären Sie detailliert den Unterschied von kovalent irreversiblen und kovalent reversiblen Inhibitoren
-> Kinetik anhand der Reaktionskoordinate betrachten
Kovalent reversibel Inhibitor:
Der Enzym-Inhibitor Komplex erreicht ein niedriges Energieniveau, aus dem eine Rückreaktion dennoch möglich ist.
Die Protein-Ligand Wechselwirkungen werden mit der Dissoziationskonstante bzw. Inhibitorkonstanten beschreiben (kd bzw. ki). Je kleiner Ki ist, um so stärker ist die Assoziation zwischen Protein und Ligand. Eine Rückreaktion (koff) wird somit erschwert.
Kovalente irreversible Inhibitoren erreichen nach der Reaktion mit dem Enzym ein niedriges Energieniveau aus dem eine Rückreaktion nicht mehr möglich ist. Deshalb wird die Reaktionskonstante nur noch als kinact beschrieben und nicht länger mit kon bzw. koff.
Dissoziationskonstanten von irreversibelen kovalenten/reversiblen kovalenten Inhibitor zeigen
Wie sind Kd und tr definiert?
Echothiophat (Handelsname: Phospholine) ist ein irreversible kovalenter Inhibitor
Wie wirkt er?
Indikation?
Pharmakodynamik/Wirkung im Körper?
Irreversible kovalenter Inhibitor:
Echothiophat (Handelsname: Phospholine), ein Organophosphat
Wirkmechanismus: ein Acetylcholinesterase Hemmer durch Phosphorylierung
Indikation: Glaukom
Pharmakodynamik: Miosis, Senkung des intraokularen Druckes, eine deutliche Abnahme des Abflusswiderstandes
Bortezomib (Handelsname: Velcade) ist ein reversible kovalenter Inhibitor
Wie wirkt er?
Indikation?
Pharmakodynamik/Wirkung im Körper?
Wirkmechanismus: bindet am Threonin des Proteasom (für Proteinabbau zuständig)
Indikation: Multiples Mylom
Pharmakodynamik: Fehlfunktion in Regulatorproteine (z.B. Cycline) und Transkriptionsfaktor -> Fehlfunktion im Zellzyklus -> Zellwachstum und Metastasierung verhindert, Apoptose
Welche Anforderungen muss ein „Warhead“ erfüllen?
Hydrolytische Stabilität
Hohe Selektivität
Keinen „negativen“ Einfluss auf den Liganden (Beeinflussung der physiko-chemischen Parameter)
Hohe Elektrophilie (z.B. durch Micheal-System)
Warum ist eine Untersuchung der Selektivität vor allem für kovalent-irreversible Inhibitoren von besonderer Bedeutung
- Selektivität spielt eine wichtige Rolle, da die Inhibitoren sehr großen Einfluss auf die Enzymregulation haben. Wenn der Inhibitor ein anderes Target angreift, kann es zur Störung der Synthese von Proteinen kommen oder ein ungewünschter Effekt tritt auf.
- Wenn Off-Targets gebunden werden oder der Inhibitor unspezifisch bindet, steigt das Toxizitätsrisiko.
- Haptenisierung kann auftreten. Das bedeutet Molekülteile des Inhibitors bilden ein Hapten, die alleine keine Immunreaktion verursachen können. Jedoch wenn das Hapten an ein körpereigenes Trägerprotein bindet, führt dies zur Bildung eines Antigens, die eine Immunantwort auslösen können.
- Der Inhibitor kann Nebenwirkungen verursachen, die schwer in den Griff zu bekommen sind. Die unerwünschte Wirkung kann lange andauern und durch das Absetzen nicht unterbrochen werden.
Erklären Sie die Grundprinzipien der Proteinkristallisation und deren Bedeutung für ein rationales Wirkstoff-Design
Aufgrund der komplexen Struktur von Proteinen können Kristallisationsprozesse wie die Verengung nicht verwendet werden, um das Löslichkeitsprodukt zu überschreiten.
Die Kristallisation ist eine sehr langsame Verdrängung von Wasser aus der Proteinlösung und die damit verbundene Erhöhung der Protein- und Sedimentkonzentration.
Mit diesem Verfahren können Proteinstrukturen ermittelt werden und Targets dargestellt werden. Wichtig für das Molecular Docking, um die vorhergesagt Bindungsaffinität festzustellen. Somit können potentielle Arzneistoffstrukturen besser eingegrenzt werden.
Erläutere die “Hanging Drop” Methode
Bei der “Hanging Drop” –Methode wird eine Mischung aus gleichen Teilen Protein und Reservoir verwendet (enthält Niederschlag (Fällungsreagenz), z. B. Ammoniumsulfat). Ein Tropfen dieser Mischung (im Folgenden als analytische Lösung bezeichnet) wird auf eine Glasplatte aufgetragen und dient als Deckel für ein mit konzentrierter Reservoir Lösung gefülltes Gefäß. Die Kristallisation basiert auf der Entfernung von Wasser aus der Analyselösung durch Dampfdiffusion, da die konzentrierte Stammlösung gasförmiges Wasser aus der Umgebungsluft des Behälters absorbiert. Zusätzlich zur Proteinkonzentration im Tröpfchen steigt auch die Konzentration des Fällungsreagens an und das Protein wird aus der Lösung verdrängt.
Erläutere die “Sit”-Methode
Geben Sie einen Tropfen Analyselösung in das Loch am Boden des Behälters und geben Sie die Stammlösung hinzu, damit sich die beiden Mischungen nicht berühren. Die Kristallisation erfolgt ebenfalls durch Dampfdiffusion. Der Unterschied zwischen der “hängenden” und der “sitzenden” Methode besteht nur in der Struktur.
Erklären Sie den Fluoreszenz-Polarisation basierten Assay zur Untersuchung der Inhibitoren
Die erste Aufgabe für das Assay ist einen geeigneten Fluoreszenzmarker für das Kompartiment 8 zu finden. Die Ethendiamin-Struktur bietet die beste Stelle zur Markierung, da es keinen Einfluss auf die Inhibition hat. Es wurden folgende Gruppen als Fluoreszenzmarker gewählt: Difluoroboron, Dipyrromethan
Der Assay dient zur Untersuchung der kompetitiven Inhibition des kovalenten (8-BODIPY) und nicht-kovalenten (Darapladib) Inhibitor an Lp-PLA2.
Zuerst wird rekombinante Lp-PLA2 mit einer verdünnten Lösung Darapladib versetzt und dann wird die Lösung 8-BODIPY hinzugegeben (eckig) àDas Signal wird schwächer bei einer steigenden Konzentration von Darapladib
Die Zugabe der Lösungen wurde getauscht (rund) à Das Signal wird etwas schwächer: die irreversibele Bindung zu Lp-PLA2 ist stärker als die reversible und sorgt so für eine Konkurrenz um die Bindetasche
Reaktivitäten lassen sich oft mit dem HSAB Konzept vorhersagen!
Ist Glutathion im Vergleich zu einer Sauerstoff haltigen Verbindung hart oder weich?
Ist weich
Weich reagiert mit weich
