Vortrag Gruppe 18:Medicinal Chemistry Strategies for the Development of Kinase Inhibitors Targeting Point Mutations

Question 1

Wofür steht SMKI?

Answer 1

small molecule kinase inhibitor

Question 2

Welche Probleme treten bei SMKIs vom Typ 1 und 2 auf?

Answer 2

binden an ATP-Bindetasche der Kinasen

• zu geringe Selektivität
• Inhibiton auch anderer Kinasen
• Aufkommen von SMKI-Resistenzen durch Entstehung von Bypass Signalwegen (off-target Resistenzen)
• Resistenzen durch sekundäre/tertiäre Mutationen in Zielkinase (on-target Resistenzen) : Gatekeeper-Residues und solvent front

Question 3

Welche Strategien zur Überwindung von Resistenzen, die durch on-target Punktmutationen hervorgerufen wurden, verfolgt man?

Answer 3

• Vermeidung sterischer Hindernisse
• Interaktionen mit mutierten Resten
• kovalente Bindung an ein Active Site-Cystein
• Resistenzen gegen irreversible SMKIs durch reversible SMKIs überwinden
• allosterische Inhibitoren
• PROTACs

Question 4

Wie können zum Beispiel sterischer Hindernisse die durch Mutationen hervorgerufen wurden umgangen werden?

Answer 4

• Einbau eines Alkin-Linker (Imatinib zu Ponatinib)
• Makocyclisierung: weniger flexible Konformation

Question 5

Vermeidung von sterischen Hindernissen

ALK-Inhibitoren

Crizotinib

Welche Mutation/en tritt auf? Wie wirkt sich diese aus?

Answer 5

Gatekeeper-Mutation

Verlust Van der Waals WW zwischen Methylsubstituenten und Leucinrest

Solvent front Mutation

sterischer Zusammenstoß des Piperidinrings aufgrund des erhöhten Volumen des Arginin-Rests

>>>Resistenzbildung aufgrund dieser Mutationen

Question 6

Vermeidung sterischer Hindernisse

ALK-Inhibitoren

Lorlatinib

Wie wurde die sterische Hinderung umgangen?

Answer 6

Regridisierung durch Makrocyclus

Question 7

Interaktion mit mutierten Resten

ALK Inhibitor Ceritinib

Wie wird die Gatekeeper Mutation umgangen?

Answer 7

durch Einführung Chlorsubstituent:

hydrophobe WW mit ATP bindenden Domäne

Question 8

Interaktion mit mutierten Resten

ALK Inhibitor Brigatinib

Wie werden die Resistenzen umgangen?

Answer 8

WW mit Chlorsubstituenten an mutierten Methioninrest

zusätzlich Einführung flexiblen Pyperidinrest >Vermeidung sterischer Hinderung

Question 9

kovalente Bindung mit der active site-cystein

Beispiel Afatinib

Strategie?

Answer 9

kovalente Bindung zwischen solvent-front cystein und Michael Akzeptor des SMKIs

>>irreversible Imhibition des Targets

Question 10

kovalente Bindung mit der active site-cystein

Beispiel Osimertinib

Strategie?

Answer 10

zusätzlich zum Michael-Akzeptor mutante selektive WW (hydrophobe WW und H-Brücken)

>U-Förmige Konformation

Question 11

Resistenz gegen irreversible SMKIs mit reversiblen SMKIs überwinden

Strategie?

Beispiel BI-4020

Answer 11

Makrocyclisierung

Rigridisierung> unter Umständen affiner zum Target

SMKI wird in seiner aktiven Form fixiert

Question 12

Überwinden von Mutationen in ATP-Bindetasche durch allosterische Inhibitoren

Beispiel:Asciminib

In welcher Bindetasche werden diese binden?

Funktionsweise?

Answer 12

binden außerhalb der ATP-Bindetasche allosterisch

>hier in Meristoylbindetasche

zum Überwinden einer durch Gatekeeper-Mutation entstandenen Resistenz

Substratmimetikum

Question 13

Induzierte Degradierung mutierter Kinasen durch PROTACs

Wofür steht PROTAC?

Funktionsweise?

Answer 13

PROTAC:Proteolysis-Targeting Chimera (“auf Proteolyse abzielendes Molekül”)

PROTACs binden an Zielprotein und E3-Ubiquitin Ligase gleichzeitig

>Zielprotein wird ubiquitiniert und abgebaut

Question 14

Wie bilden sich Punktmutationen bei den Kinasen in Krebszellen auf der molekularbiologischen Ebene aus?

Answer 14

• durch hydrolytische Desaminierungen oder Methylierungen der DNA-Basen

>>bei Replikationen Fehlpaarungen

Zb. Cytosin zu Uracil

Adenin zu Hypoxanthin

Methylierung von Cystein zu 5.Methylcystein durch SAM>Desaminierung zu Thymin

• anderer Grund: chemische Mutagene führen zu Veränderungen der DNA und Mutationen der Kinasen

Question 15

Warum sind Krebszellen mit sekundären Mutationen gefährlicher?

Answer 15

• Gabe von SMKI zur Behandlung der primären Mutation>Selektionsdruck
• wenn sekundäre Punktmutation unf Aufbau Resistenz gegen SMKI

>schnellere Replikation

Question 16

Warum ist die targeting point mutations-Strategie vor allem für Kinasen als Targets relevant?

Answer 16

• humanes Kinom (Gesamtheit aller hum. Proteinkinasen) sehr groß ist
• Kinasen häufig entscheidende Stellen der Signaltransduktion darstellen

> Selektivität von SMKIs sehr wichtig

• mit targeting point mutations-Strategie können Wirkstoffe auf bestimmte Mutanten der Kinasen abzielen.
• beispielsweise durch die Interaktion der SMKIs mit mutierten Reste

Question 17

Wie wird die Indikation eines Arzneistoffs für einen Patienten mit einer spezifischen Mutation ermittelt?

Answer 17

personalisierte Medizin: molekulargenetischer Untersuchung

• Probe: mittels Liquid Biopsy (Blut, nicht invasiv) oder gewöhnlicher Gewebeentnahme. Diese Probe muss anschließend sequenziert werden

Question 18

Wie wird das Genom untersucht?

Answer 18

• Next-Generation Sequencing (NGS): Nachweis von Varianten in der DNA-Sequenz:
  
  • Einzelnukleotid-Variation (SNV),
  • Insertion-Deletion (Indels),
  • strukturelle Variationen (SV) und
  • Änderung der Kopienzahl (CNA). .

Question 19

Welche Information gewinnt man aus der Transkriptom-Analyse?

Answer 19

• über die RNA-Sequenzierung Nachweis von:
  
  • neuartige Transkriptionen,
  • Genfusionen,
  • SNV,
  • Indels nachgewiesen
  • Quantifizierung der Genexpression

Question 20

Was sind epigenetische Marker?

Answer 20

• DNA-Methylierung,
• die Histon-Modifikation
• veränderte DNA-Protein-Interaktion.

Question 21

Wonach werden die Mutationen nach Identifizierung unterschieden?

Answer 21

passenger oder driver

“driver” : Fördert Wachstum von Malignomen direkt oder indirekt .

“passenger”:trägt nicht zum Wachstum bei, entsteht aber während der Progression eines Tumors.

Question 22

An welchen Strukturmerkmalen der Kinasen bilden sich begünstigt Punktmutationen aus?

Answer 22

• gatekeeper-Mutationen: Mutationen im Eingangsbereich der ATP-Bindetasche
• Solvent-front Mutationen: Mutationen in der Nähe der Bindetasche, die aus der Kinase in die wässrige Umgebung hinausragen.
• (Mutationen von Cysteinen, die mit kovalenten SMKI´s reagieren: Diese Mutationen spielen nur bei kovalent reversiblen und irreversiblen SMKI`s eine Rolle)

Question 23

Was ist ein Gatekeeper?

Answer 23

• Oft sind Aminosäuren wie Threonin, die als Teil des activation loop die Aktivität der jeweiligen Kinase regulieren.
• Im inaktiven Zustand blockiert Threonin so den Zugang zur Bindetasche, indem es Wasserstoffbrücken zu anderen Aminosäuren ausbildet und das Gate verschließt.
• Wird Threonin durch eine vorgeschaltete Kinase phosphoryliert, bildet sich bevorzugt eine Salzbrücke zu einer anderen Seitenkette (z.B. Arginin) mit positiver Ladung aus; das Gate ist nun offen, ATP kann binden und die Kinase ist aktiv.

Question 24

Was ist eine Gatekeeper-Mutation?

Answer 24

• Mutation im Eingangsbereich der ATP-Bindetasche
• Zb: Mutation des Threonins zu Methionin: keine Regulation mehr, weil Methionin das Gate nicht mehr effektiv verschließt (keine Wasserstoffbrücke).
• Die Kinase ist daher (wenn keine weiteren Regulationsmechanismen vorliegen) konstitutiv aktiv.
• Inhibitor kann ggf aufgrund sterischer Hinderung nicht mehr an die Kinase binden kann.

Question 25

Was bezeichnet man als solvent-front Mutationen?

Answer 25

• Mutationen in der Nähe der Bindetasche, die aus der Kinase in die wässrige Umgebung hinausragen.
• Im Gegensatz zu Gatekeeper Mutationen:keine Beeinflussung der ATP-Bindung
• können sterische Interaktionen mit SMKI´s ausbilden und deren Affinität zum Target mindern.
• Interaktionen entstehen vor allem mit dem Teil des Inhibitors, der aus der ATP-Bindetasche herausragt

Question 26

Was sind die Vor- und Nachteile der form covalent bond-Strategie?

Answer 26

Vorteile:

• Target dauerhaft gehemmt und muss von der Zelle neu synthetisiert werden

Nachteile:

• massiven Off-target Wirkungen, unselektives Abreagieren auch an anderen Kinasen
• Target kann nicht mehr seine physiologische Aufgabe erfüllen
• nach irreversibler Inhibition des Targets: Proteolyse> Bildung von Peptidfragmenten wo Inhibitor noch gekoppelt > Haptenisierung eines körpereigenen Peptids & Immunreaktion des Körpers

Question 27

Mutationen von Cysteinen, die mit kovalenten SMKI´s reagieren

Für welche SMKIs relevant?

Wie äußern sich diese Mutationen?

Answer 27

• nur bei kovalent reversiblen und irreversiblen SMKI`s
• Ein Cystein (wwird durch eine Punktmutation mit einer anderen Aminosäure ersetzt
• keine Reaktion mehr mit Michael-Akzeptor des SMKI`s
• Inhibitor verliert seine Affinität zum Target
• Nebenwirkungen durch Reaktionen mit Off-Targets auf

Question 28

Bei der making interactions-Strategie sollen zusätzliche physikochemische Interaktionen generiert werden. Welche Typen von physikochemischen Wechselwirkungen zwischen Proteinen und small molecules kennen Sie?

Answer 28

• H-Brücken (10-20 kJ/mol): oft sind polare Seitenketten wie Tyrosin, Serin oder Glutamin an Wasserstoffbrücken beteiligt
• Ionischen Wechselwirkungen/Salzbrücke(250 kJ/mol):ypische Reste sind Asparaginsäure, Arginin und Histidin.
• π-WW π - π (50 kJ/mol), OH - π (<10 kJ/mol) und Kation - π(variabel):aromatische AS oder Lysin
• Van-der-Waals-Wechselwirkung (hydrophob) :0,5-5 kJ/mol.

Question 29

Wie könnte man die Nachteile durch kovalent-reversible Inhibitoren adressieren?

Answer 29

• Bei Verwendung kovalent-reversibler Inhibitoren: Bildung einer kovalenten Bindung eine hohe Affinität zum Target erhalten
• bei einem Target-selektiven Design des Inhibitors weitere WW zu anderen AS-Seitenketten (welche bei Off-targets nicht vorliegen)
• Diskrepanz zwischen den Affinitäten vom jeweiligen Target und den Off-targets verringert die Toxizität
• eventuelle gebildete peptidische Antigene aufgrund der Reversibilität nicht stabil