Gruppe 20: Automated Microscale Thermophoresesis Screening/FBLD Flashcards
Wofür steht MST?
Was ist der Thermophorese-Effekt?
MST: Microscale Thermophoresis
Thermophorese-Effekt: Als Thermophorese, Thermodiffusion oder Ludwig-Soret-Effekt wird in den Naturwissenschaften die Bewegung von Teilchen aufgrund eines Temperaturgradienten innerhalb eines Fluids bezeichnet.
Wie läuft das MST-Screening ab?
- Messe Fluoreszenz am Anfang
- Probe mit IR-Laser bestrahlen
- Temperatur in der Mitte der Platte steigt an
- > Moleküle diffundieren an den Rand der Platte (Thermophorese-Effekt)
- > Gemessene Fluoreszenz nimmt ab - Laser aus -> Platte kühlt ab -> Moleküle wandern wieder in die Mitte der Platte
- Führe selbe Schritte mit anderen Konzentrationen durch
- Auswertung: Fluoreszenz korreliert mit Substratkonzentration korreliert mit Wandergeschwindigkeit korreliert mit Bindungsereignis (Enzym + Ligand) hervorgerufene Veränderung der Größe, Ladung und Hydrathülle (durch Änderung der Solvatationsentropie)
Was trägt man beim MST-Screening auf? (Ergebnis)
Auftragung der normierten Fluoreszenzänderung ΔFnorm (als Verhältnis der Fluoreszenz nach gewisser MST-on-time und der Fluoreszenz vor Aktivierung des IR-Lasers) gegen die Ligandenkonzentration
-> Sigmoidale Dosis-Wirkungskurve erhalten, aus welcher durch Fitten die Dissoziations-konstante KD, ergo die Bindungsaffinität bestimmt werden kann.
Wofür steht SPR?
Wofür kann man SPR einsetzen?
Surface Plasmon Resonance (SPR)
SPR ermöglicht markierungsfreie Protein-Interaktionsanalysen in Echtzeit.
Wie läuft Surface Plasmon Resonance (SPR) ab?
- Zielmolekül auf der goldbeschichteten Glasoberfläche eines Sensorchips immobilisieren
- Analyt, verdünnt in einem Laufpuffer, über das Zielmolekül injiziert.
- Laser-erzeugtes polarisiertes Licht auf die Rückseite der Goldschicht gerichtet, an dessen Grenzfläche es unter einem Grenzwinkel totalreflektiert wird.
- > Der Winkel hängt vom Brechungsindex des Mediums in der Näher der Goldoberfläche ab.
- > Ein Bindungsereignis führt zu einer Brechungsindexänderung, welche in einer Verschiebung des Resonanzwinkels des reflektierten Lichts resultiert - Brechungsindexänderung mit Hilfe eines Diodenarrays detektiert und in ein entsprechendes Signal übersetzt
SPR Auswertung
Was ist die hierfür wichtige Einheit?
Die Signalstärke ist proportional zu der, an der Sensoroberfläche gebundenen, Masse und wird in Resonanz-Einheiten (Resonance Units, RU) angegeben. Dabei entspricht 1 RU der Masse von 1 pg/mm2.
Aus dem Sensorgramm (≙ Auftragung RU gegen t, können die kinetischen Parameter der Assoziation (kon) und Dissoziation (koff) ermittelt und damit auch die Bindungsaffinität (KD) berechnet werden 𝐾𝐷=𝑘off/𝑘on
Zur Bestimmung der Bindungsaffinität kann auch die Auftragung der RU im Gleichgewicht gegen die Ligandenkonzentration genutzt werden. (Siehe Abbildung)
Wofür steht DSF?
Wofür kann man sie einsetzen?
Differential Scanning Fluorimetry (DSF)
Die DSF ermöglicht die Überwachung der thermischen Entfaltung von Proteinen in Gegenwart eines Fluoreszenzfarbstoffs (z.B. SYPRO orange) und kann als Screening-Methode zur Identifizierung von Liganden, die gereinigte Proteine binden und stabilisieren, genutzt werden.
Wie wird die DSF durchgeführt?
- Wähle ein Enzym und versetze es mit Fluoreszenzfarbstoff (z.B. SYPRO orange)
- Erhite das Enzym langsam
- > Das Enzym beginnt sich zu entfalten - Fluoreszenzfarbstoff bindet an freigesetzte hydrophobe Bereiche
- > Fluoreszenz nimmt zu - Trage Fluoreszenz gegen Temperatur auf
Wie kann DSF genutzt werden um Enzym Ligand Wechselwirkungen zu untersuchen? Was ist das Prinzip?
Grundliegendes Prinzip: Fähigkeit von kleinen Molekülen, welche an das Zielpro-tein binden, dessen Tertiärstruktur zu stabilisieren oder destabilisieren und dadurch seine Schmelztemperatur TM zu erhöhen bzw. zu senken.
Welche Modifikation des zu untersuchenden Proteins ist vor MST-Messungen erforderlich?
Wie kann diese z.B. erfolgen?
Hat die Einführung eines Fluorophors Einfluss auf die thermische Stabilität?
MST-Screening-Methode: Fluoreszenzdetektion
-> Target-Protein muss zur erfolgreichen MST-Messung eine Fluorophore-Gruppe tragen.
Zwei Möglichkeiten:
- Intrinsische Fluoreszenz (Target fluoresziert eigenständig) wegen aromatischen AS
- Extrinsische Fluoreszenz (fluorophore Gruppe) muss von außen eingeführt werden
-> Markierung erfolgt häufig an einem primären Amin
Keine Beeinträchtigung der thermischen Stabilität durch das Fluorophor!
Woran ist Proteinaggregation in MST-Experimenten zu erkennen?
Liegt eine monodisperse und homogene Lösung einer fluoreszierenden Verbindung (z.B. Protein) vor, kann bei den Molekülen eine identische thermophoretische Bewegung innerhalb des Temperaturgradienten beobachtet werden.
Eine Probe, welche aggregierte Proteine enthält, ist ein inhomogenes Gemisch von verschiedenen Spezies an fluoreszierenden Molekülen, welche sich in Fluoreszenzintensität und thermophoretischen Eigenschaften stark unterscheiden. Dementsprechend besitzen die MST-Spuren solcher Probelösungen eine aberrante Form mit großen Schwankungen, welche mit einem einfachen mathematischen Fit nicht berechnet werden können
Ab welcher Schwankung kann man auf Aggregation des markierten Proteins schließen?
Was können Fehlerquellen sein?
Was kann auch noch auf Aggregation hinweisen?
Schwankungen der Fluoreszenzintensität im Kapillarscan > 10% weisen auf eine Aggregation des markierten Proteins hin, können jedoch auch von Pipitierfehlern, Adsorption an Kapillarwänden/Laborgeräten oder Liganden induzierter Fluoreszenzlöschung verursacht werden.
Neben dem Effekt der Aggregation können unregelmäßige MST-Zeitspuren oder Fluoreszenzverlust auch auf Denaturierung hinweisen.
Eine Änderung, speziell in der Rückdiffusion, kann ebenfalls auf eine Aggregation oder Oligomerisierung hindeuten, wenn keine signifikante Größenänderung zu erwarten ist, also im Falle einer Bindung von kleinen Fragmenten oder Molekülen.
Erläutern Sie Vorteile von FBDD.
- Erfordern deutlich weniger Verbindungen, die gescreent und synthetisiert werden müssen
- Identifizierung von sehr kleinen Fragmenten (150−300 Da)
- Hohe Erfolgsrate bei der Erzeugung chemical series mit Leitstruktur-ähnlichen Eigenschaften
Erläutern sie Nachteile von FBDD
- Eingeschränkte Assays (i.d.R. biophysikalische Methoden), sowie Design der Fragmentenbibliothek
➔ Bedingt durch die normalerweise geringen Bindungsaffinitäten (mM−30 μM) der Fragmente und ihrer Löslichkeit bei hohen Konzentrationen, die für die Assays benötigt werden
- Erfordert Fachwissen und Kenntnisse über Proteinstruktur, Protein-Ligand-Bindungswechselwirkung und Fragmentdesign
- Fragmenten-Bibliothek muss regelmäßig auf Stabilität (Ausfällung/Aggregation) der Fragmente überprüft werden
-> Sonst kann es zu falsch-positiven Ergebnissen führen
In welcher Größenordnung liegt die Anzahl an verschiedenen Molekülen die bei FBDD eingesetzt wird?
1000