Vorlesung 3: Screening & Bio(phys)assays I Flashcards
Was misst man mit einem Bioassay?
Was ist ein phänotypisches Screening?
Was ist off-Target Wirkung?
Konzentration oder biologische Aktivität messen
Screening von neuen Molekülen ohne das Target zu kennen
-> Wird z.B. bei Parasiten gemacht
Wirkung an anderen biologischen Strukturen, die nicht dem Target entsprechen
-> Wirkung ist manchmal toxisch
HTS
Wofür steht die Abkürzung?
Wie viele Well hat eine Platt normalerweise die man per Hand pipettieren kann?
In der Industrie werden mehr Wells verwendet 1536 oder 3456 -> Probleme?
High Throughput Screening
Normalerweise: 96
Kleinere Wells -> Weniger Volumen aber dafür mehr Oberfläche
Probleme: Verdunstung und Target könnte an Well kleben bleiben
Allgemeine Probleme HTS: Falsch positiv (PAINS)/falsch negativ (Nicht empfindlich genug)
Was sind PAINs?
Bewirken was?
Unten ist ein typisches PAIN gezeigt. Name?
Weitere Beispiele?
Pan-assay interference compounds
-> Falsch-positive Hits
Rhodanin
Azo-,Cyano- und auch Michael Akzeptor Systeme
Wie führen PAINs zu falsch positiven Ergebnissen?
- Kovalente Bindung
- Chelator Wirkung
- Redoxreaktion
- Spektrophotometrisch (Weil Auswertung oft über Spektroskopie läuft)
PAINs
Zeige wo die reaktiven Gruppen sitzen und was passieren kann
Sind PAINs immer falsch positiv?
Nein z.B. Rosiglitazon
-> Fettsäuremimetika
Falsch-positive Hits durch Aggregatoren
Wie sehen sie molekular aus?
Woran erkennt man sie?
Wie kann man testen um Aggregation auszuschließen?
Meist lipophile Substanzen
Steile Dosis-Wirkungs-Kurve (alles oder nichts) und nicht sigmoidal
Zeigen keine Aktivität in Anwesenheit eines nicht-ionischen Tensids
Oder man prüft ob sich Aggregate gebildet haben (z.B. mit Elektronenmikroskop)
Falsch-positive Hits durch reaktive Substanzen
-> Welche Eigenschaften/Aussehen haben sie meist?
Welche Aminosäure ist hier meist betroffen?
- Elektrophile
- Polyanionen
- Chelatoren
Cystein ist oft Reaktionspartner
Beispiel ist z.B. Aldehyd
Drugability (Def.)
Was beschreibt die Ligand Efficiency beim FBS (fragment based screening)?
Kann Target überhaupt durch ein Molekül addressiert werden?
-> Welches die Rule of five erfüllt
Affinität des Hits in Relation zu den schweren Molekülen die es besitzt
Ligand Efficiency
Wie berechnet man es?
Warum macht man das?
Liganden miteinander vergleichbar um den besten Liganden auszuwählen für Optimierung
Welcher Wert für LE sollte erhalten werden?
LE > 0,3 kcal/mol
Lipophilic Ligand Efficiency (LLE)
Wie wird es berechnet und welche Parameter werden dadurch verbunden?
Verknüpft Potenz (möglichst hoch, dh niedriger IC50, hoher pIC50) mit Lipophilie (log P) (log P möglichst zw. 2 und 3) Kompromiss zwischen guter Lipophilie, die notwendig ist für BV, aber nicht zu lipophil, da ansonsten
schlechtere BV.
- > Idee ist: Man beginnt mit einem kleinen Molekül welches man optimieren will. Dafür werden aber weitere Gruppen angehängt, d.h. die Lipophilie wird zunehmen und man läuft Gefahr das man zu lipophil wird und die Bioverfügbarkeit sinkt.
- > Heißt man sollte mit einem Molekül beginnen welches guten LE besitzt und eher hydrophil ist
Wofür stehen diese Abkürzungen?
Bindungsassay mathematisch beschreiben
- Reaktionsgleichung für Ligand + Bindepartner aufschreiben
- KD aufschreiben (Wie ist der Wert definiert?)
- Welche Annahme kann man machen um damit eine Sättigungskurve zu erhalten?
- Umformen
[L] + [B] -> [BL] (Gleichgewicht)
KD über Massenwirkungsgesetz:
I KD = [B] * [L] / [BL]
Annahme: II [Bmax] = [Bfrei] + [Bbound] = [B] + [BL]
(Heißt Bindepartner liegt entweder alleine oder an Ligand gebunden vor)
- > Gleichung II in Gleichung I -> [BL] = [Bmax] * [L] / (KD + [L])
- > Erhalte Sättigungskurve
Was ist der Scatchard-Plot?
Erst Sättigungskurve erhalten [BL], dann linearisieren durch [BL]/[L]
Versuche einen Bindeassay zu erhalten für einen D4-Rezeptor Antagonisten (Nemonaprid)
- > Problem es gibt auch D2 und D3 auf Zellmembran an die das Medikament binden kann
- > Wie kann man gezielt nur einen Bindeassay vom D4-Rezeptor erhalten?
- Markiere den Arzneistoff radioaktiv mit Tritium und teste die Bindung über die Radioaktivität
- Inhibiere D2 und D3 mit Antagonisten und teste wieder mit radioaktiv markierten Arzneistoff
- > Differenz ist Wert für D4
Was wird beim funktionalen Assay gemessen?
Was sind die Annahmen die man machen muss, damit man hier Berechnungen durchführen kann?
Welche “Gleichung” kann man durch diese Annahmen ableiten?
Messe nicht Ligand Target Interaktion sondern die biologische Antwort (den Effekt)
- Effekt ist proportional zum Ligand Target Komplex
E ~ [BL]
- Maximaler Effekt wird dann erreicht, wenn alle Targets belegt sind
EMax ~ {BL]Max
[BL]/[BL]Max = E/EMax
Vergleiche einen funktionellen Test mit einem Bindungsassay
Was für Kurven erhält man?
Was wird jeweils gemessen?
Probleme?
Wie sieht ein Agonist und ein partieller Agonist in einer Dosis-Wirkungs-Kurve aus?
Wie sieht ein Antagonist in einer Dosis-Wirkungs-Kurve aus?
Was ist das Maß für Aktivität eines Antagonisten?
Wie ist der IC50 Wert definiert?
Was ist hierbei zu beachten?
Konzentration eines Antagonisten die benötigt wird um die Enzym Aktivität oder den Effekt um 50% zu reduzieren
-> Hängt stark von den experimental Bedingungen ab (z.B. Konzentration des Agonisten)
Die Inhibitions Konstante, Ki beschreibt die „Bindungsaffinität des Inhibitors“.
Wie lässt sich diese mathematisch beschreiben?
Ki = [E]*[I]/[EI] = koff / kon
Wie lautet die Michaelis Menten Gleichung?
Wie sieht ein Michaelis Menten Diagram aus?
Wie kann man daraus Parameter ablesen?
Wie sieht das Michaelis Menten Diagram und der Lineweaver-Burk Plot bei einer kompetitiven Hemmung aus?
Wie sieht das Michaelis Menten Diagram und der Lineweaver-Burk Plot bei einer nicht kompetitiven Hemmung aus?
Nicht-kompetitive Hemmung: Bindung an allosterische Stelle, unabh. von Substratkonz. und dessen Affinität zum Enzym
Wie sieht das Michaelis Menten Diagram und der Lineweaver-Burk Plot bei einer un-kompetitiven Hemmung aus?
Un-kompetitive Hemmung: Bindung nur an ES-Komplex -> bessere Hemmung in Anwesenheit von mehr Substrat
Welcher Parameter ist ein Index für Qualität und Robustheit gegenüber Störfaktorenmuss und muss geprüft werden?
Welche Einheit hat dieser Parameter?
Was wird dabei eingesetzt?
Z‘ factor
Dimensionsloser statistischer Parameter
Ohne Test-Compound (nur Positiv-, Negativkontrolle)
Wie lautet die Formel für den Z‘ factor?
Welchen Wert sollte man erhalten?
Werte: 0 (sehr schlecht) zu +1 (sehr gut).
HTS: Z‘ factor > 0.5
Wofür steht DSF?
Alternativer Name?
Wie läuft dieser Test ab?
Differential Scanning Fluorimetry
Thermal Shift Assay (TSA)
- Protein besitzt auf Außenseite hydrophile und auf Innenseite hydrophobe Rest
- Wird erhitzt, dabei kommen die hydrophoben Reste nach außen
- > Fluoreszenz Farbstoff kann an diese Reste binden und Signal verursachen - Nach einer Weile sind alle hydrohoben Reste besetzt -> Signal maximal
- Danach folgt Protein Aggregation und Farbstoff dissoziiert ab
DSF/TSA
Wo liegt Tm?
Was passiert wenn ein Ligand an das Protein bindet? -> Wie verändert sich die Kurve?
Temperatur bei der das halb maximale Signal erhalten wird
Kurve wird nach rechts verschoben
ITC
Wofür steht diese Abkürzung?
Wie ist der Versuchsaufbau?
Isothermal Titration Calorimetry
Zwei Gefäße mit Flüssigkeit bei der gleichen Temperatur
Eine davon enthält das Protein
Dann Injection Ligand -> Temperaturveränderung durch Ligand Enzym Bindung
-> Messe Temperaturdifferenz
Bei der ITC wird durch das Zutropfen eines gelösten Liganden zu einer Lösung des Targets ein Wärmesignal erhalten
-> Erläutere was passiert und wie ausgewertet wird
Gelöster Ligand (L) wird tropfenweise zu einer Lösung des Targets (R) titriert.
Bei jedem Tropfen tritt ein Wärmesignal auf, das immer schwächer wird, je mehr
das Target (R) mit Ligand (L) gesättigt wird.
Aus dem Kurvenverlauf ergibt sich die
Gleichgewichtskonstante K
Berechnung von Delta G
Integration über alle Signale liefert gesamte Wärmetönung Delta H
Berechnung von Delta S
Wie lauten die thermodynamischen Formeln für die Auswertung der ITC?
Gleichgewichtskonstante K = ?
Zusammenhang Delta G mit K
Zusammenhang Delta G mit Delta S
Aus dem Kurvenverlauf ergibt sich die Gleichgewichtskonstante K
-> Kann Delta G berechnen
Integration über alle Signale liefert gesamte Wärmetönung Delta H
-> Kann Delta S berechnen
