ZO 9.4 Nieuwe ontwikkelingen in de genetica Flashcards
(36 cards)
Hoeveel aangeboren afwijkingen verwacht je bij een chromosoomafwijking en hoeveel verwacht je er bij een puntmutatie of deletie van één gen?
In het algemeen vertonen patiënten met een chromosoomafwijking een aantal verschillende aangeboren afwijkingen. Ook bij een puntmutatie of deletie van één gen kunnen meerdere aangeboren afwijkingen in één individu worden waargenomen.
Wat pikt een SNP-array op?
Een verandering van het normaal aantal kopieën van genen, ook wel een copy number variation (CNV) genoemd, kan met een SNP array opgepikt worden.
Hoe werkt SNP-array?
Een SNP array is een drager waarop in hoge dichtheid korte stukjes DNA (oligo’s) gespot zijn. Deze oligo’s liggen over het hele genoom verspreid, maar bepaalde (vaak minder informatieve) regio’s zoals de centromeren worden uitgesloten. Door, na hybridisatie op het DNA, naast de oligo’s een fluorescente nucleotide in te bouwen is naast de informatie over het aantal kopieën ook zichtbaar of het DNA homozygoot of heterozygoot voor een SNP (single nucleotide polymorfisme) op die positie is.
Hoe lees je een SNP-array af?
De GSA-24 v3.0 SNP array, een veel gebruikte diagnostische SNP array, bevat ruim 600.000 SNPs verdeeld over de 22+XY chromosomen. In figuur 1 zijn alle chromosomen weergegeven (links chromosoom 1 en uiterst rechts chromosoom Y). In het bovenste gedeelte van het plaatje zien we de Log2 ratio (ook LogR genoemd). Dit geeft het aantal kopieën weer (normaal (2n)=0, extra= + en verlies = –). In het onderste gedeelte van figuur 1 is de B-Allel Frequentie (BAF) (zie tekst blok en figuur 2) uitgezet (1=homozygoot: BB =100% ; 0.5=heterozygoot: AB =50% en 0= homozygoot: AA=0%). Als de LogR omhoog gaat zijn er meer kopieën, als de LogR omlaag gaat zijn er minder kopieën.
Hoe kun je de B-allel frequentie interpreteren?
B-allele Frequency (BAF) Met de SNP informatie op de arrays wordt de BAF, de frequentie van het “B” allel, bepaald. In diploïde DNA zijn AA, AB, en BB allelen mogelijk. Bij verlies van een allel blijft alleen een A of B allel over. Bij winst is er een extra kopie aanwezig en zien we de 3 allelen in 4 combinaties: BBB, BBA, BAA en AAA (Figuur 2).Figuur 2: B-allel frequentie in het geval van 3 allelen (in het geval van een duplicatie).
Hoe werkt de B-allelfrequentie?
Bij verlies van een chromosoom of gedeelte van een chromosoom houdt men nog maar één allel over: de LogR waarde daalt naar -0.5 en er is sprake van 100% B of 0% B (=100% A) in de B-allel frequentie. Bij winst is er sprake van extra materiaal: de LogR waarde stijgt naar +0.37 (van 2 naar 3 kopieën) en bij de BAF komt er een extra allel bij: 100% BAF: BBB; 66% BAF: BBA, 33% BAF: BAA; en 0% BAF: AAA.
Leiden copy number afwijkingen altijd tot pathologie?
Sommige kleinere copy number afwijkingen worden ook in de normale gezonde populatie gevonden en zijn onschuldige polymorfismen. Van andere deleties of duplicaties is bekend dat ze ziekte veroorzakend zijn. Deze copy number afwijkingen zijn meestal groter dan de bekende polymorfe gebieden. Zie hier onder nog enkele voorbeelden.
Wat is aneuploïdie?
Wanneer een volledig chromosoom een copy number afwijking vertoont spreekt men van aneuploïdie. Aneuploïdie duidt op de aanwezigheid van meer of minder dan het normale aantal van 46 chromosomen (=2n) in de celkern.
Wat is polyploïdie?
Polyploïdie is het voorkomen van een of meer extra set(s) haploide (n) chromosomen in de celkern, bijvoorbeeld na een dubbele bevruchting (3n=69 chromosomen) of als gevolg van het uitblijven van de celdeling na de kerndeling (4n=92 chromosomen).
Welke aneuploidieën zijn als enige levensvatbaar?
De enige levensvatbare autosomale aneuploidieën zijn trisomieën van de chromosomen 13, 18 en 21 die leiden tot resp. Patau, Edwards en Down syndroom. Levensvatbare aneuploidieën van de geslachtschromosomen zijn bijvoorbeeld monosomie X (45,X: Turner syndroom), trisomie X (XXX: triple X), disomie Y (XYY male) en een extra X chromosoom (XXY: Klinefelter syndroom).
Hoe ontstaan aneuploidieën?
Aneuploidieën ontstaan ten gevolge van een onjuiste verdeling van de chromosomen (non-disjunctie) tijdens de kerndeling (mitose/meiose). Als gevolg van non-disjunctie heeft na de kerndeling één van de twee dochtercellen een chromosoom te veel (2n+1=47 in het geval van mitose en n+1=24 in het geval van meiose). De andere dochtercel heeft dan een chromosoom te weinig (2n-1=45 in het geval van mitose en n-1=22 in het geval van meiose; zie figuur 4). Deze dochtercel gaat meestal verloren als gevolg van apoptose.
Hoort dit profiel bij een mannelijke of vrouwelijke patient? Is er sprake van een aneuploïdie en zo ja, welke?
Trisomie 21, man.
Wat zijn de LogR en BAF waardes van dit chromosoom en hoe vertaalt dit zich tot een of meer extra kopieën?
De LogR waarde is net iets lager dan 0.5, daarmee is er 1 extra kopie van chromosoom 21 . Bij 2 extra kopieën (48,XY,+21,+21) zou dit hoger zijn. De BAF toont waardes bij 0 en 1.0, maar ook rond 0.35 en 0.65, passend bij de aanwezigheid van 1 extra kopie.
Kan met deze vorm van SNP array diagnostiek worden vastgesteld of er sprake is van een mozaïek-patroon? Zo ja, hoe zou dat er dan uitzien. Zo nee, waarom niet?
Ja dan zou echter de logR wat lager liggen, en de BAF ook anders liggen. Bv bij 50% mozaïcisme (46,XX[50%]/47,XX,+21[50%]) ligt de BAF bij heterozygote allelen bij 40/60%.
Kan met een SNP array worden vastgesteld of er sprake is van een erfelijke vorm van de aandoening, bijvoorbeeld door een Robertsoniaanse translocatie? Een Robertsoniaanse translocatie is een fusie van een acrocentrisch chromosoom met een ander acrocentrisch chromosoom (13, 14, 15, 21 en 22)?
Nee, met SNP array kan alleen verlies of winst van materiaal worden aangetoond, maar is niet duidelijk op welke manier dit verlies of winst aanwezig is. Het verlies van de p-armen van deze acrocentrische chromosomen is niet te detecteren omdat er geen probes op de korte p-armen van deze chromosomen liggen. Bij een ongebalanceerde Robertsoniaanse translocatie zal daarom alleen winst van chromosoom 21 zichtbaar zijn op array. Bij een gebalanceerde Robertsoniaanse translocatie is er geen sprake van verlies van coderend materiaal en zie je een normaal arrayprofiel. In Figuur 6 zie je een voorbeeld van een dergelijke translocatie (tussen chromosoom 13 en 14 in dit geval).
In figuur 7 zijn de LogR waarden en BAF van verschillende numerieke chromosoom X afwijkingen weergegeven. Panel 1, 3, 5 en 7 geven het normale vrouwelijk patroon, met twee X verschillende allelen weer: XX. Panel 2, 4 en 6 zijn afwijkend: Bestudeer de LogR waarden en BAF in de afwijkende panels.
Rechts van de figuur zie je 3 pijlen die de verschillende logR waarden aangeven. Hoeveel kopieën van chromosoom X zou je verwachten bij de logR waarden die horen bij A, B of C?
- A: 3
- B: 2
- C: 1
In figuur 7 zijn de LogR waarden en BAF van verschillende numerieke chromosoom X afwijkingen weergegeven. Panel 1, 3, 5 en 7 geven het normale vrouwelijk patroon, met twee X verschillende allelen weer: XX. Panel 2, 4 en 6 zijn afwijkend: Bestudeer de LogR waarden en BAF in de afwijkende panels.
En welke B-allel frequenties zie je weergegeven in onderstaande panels?
- Panel 1 (als voorbeeld): AA, AB en BB
- Panel 2 (als voorbeeld): AA en BB. AB is hier afwezig.
- Panel 4: AA en BB, AB is hier afwezig
- Panel 6: Hier zijn in totaal 3 allelen: AAA, AAB, ABB en BBB.
- Panel 7: Als 1, dus AA, AB en BB
Wat is het geslacht van deze patiënt?
Vrouw
Bij deze patiënt is er sprake van een chromosoomafwijking waarbij chromosoom 5 en 6 betrokken zijn. Omschrijf de afwijking en teken de afwijkende chromosomen (teken behalve de twee afwijkende chromosomen ook de twee homologe normale chromosomen, zie voorbeeld hieronder).
Bij patiënt is sprake van een ongebalanceerde translocatie, waarbij een deel van chromosoom 5 aan chromosoom 6 is “geplakt”. Hierbij ontstaat een tekort van (een deel van) chromosoom 5, en een teveel aan (een deel van) chromosoom 6. Er is daarom sprake van een zgn. derivaat chromosoom 5 opgebouwd uit een translocatie tussen chromosomen 5 en 6: der(5)t(5;6)(p14.3;p24).
Stel dat de moeder van deze patiënt draagster is van de gebalanceerde vorm van deze chromosoomafwijking. Teken in figuur 9 de homologe chromosomen van de moeder die betrokken zijn bij de gebalanceerde afwijking.
Welke chromosoom combinaties kan ze doorgeven aan haar eventuele nakomelingen en wat verwacht je van deze combinaties?
In een kwart van de nakomelingen zijn de normale chromosomen 5 en 6 doorgegeven, in een kwart van de nakomelingen heeft moeder beide derivaatchromosomen doorgegeven, dus een gebalanceerde translocatie. In de helft van de nakomelingen komt een ongebalanceerde translocatie voor: soms met verlies van chromosoom 5 en winst deel chromosoom 6 (derivaat chromosoom 5 met normaal chromosoom 6) en omgekeerd, soms extra chromosoom 5 en verlies van chromosoom 6 materiaal (normaal chromosoom 5 met derivaat chromosoom 6).
Wanneer is een fenotype bij de moeder te verwachten?
Je verwacht bij moeder geen fenotype, de translocatie is immers gebalanceerd. Maar, als de translocatie door een gen gaat en een effect heeft op de hoeveelheid of structuur van het gen product, kan ook in de gebalanceerde situatie een fenotype ontstaan.
Hoe werkt NGS?
Met behulp van NGS (Next generation sequencing) kan binnen één experiment van een grote hoeveelheid genomisch DNA de nucleotide volgorde bepaald worden (sequencen). Hiervoor fragmenteert men het genoom in kleine DNA fragmenten die vervolgens m.b.v. speciale technologie base voor base afgelezen worden. Om tijd en geld te besparen kan men alleen die fragmenten isoleren waar men in geïnteresseerd is (DNA capture), bijvoorbeeld alle 22.000 coderende gengebieden (ook wel een exoom genoemd, ~1% van het totale DNA). Na deze selectie worden de DNA fragmenten geamplificeerd en wordt van beide uiteinden een circa 100 basen lange DNA volgorde bepaald. Op deze manier worden enorme aantallen korte DNA sequenties van ~100 bp lang geproduceerd, de zgn reads.
Deze fragmenten worden weer teruggeplaatst op het referentiegenoom (mapping) en de verschillen t.o.v. dit referentie genoom genoteerd (variant calling). Dit referentie genoom is een “bevroren” internationaal gebruikte humane DNA referentie. Vervolgens worden de gevonden varianten gefilterd en het effect van de variant bepaald (classificeren). Voor een betrouwbare analyse heeft men een minimum aantal reads op een te onderzoeken positie nodig. In de regel geldt, dat hoe meer van het genoom er bekeken wordt, hoe lager het aantal reads per positie is. Gemiddeld worden 100.000 varianten per exoom gevonden.
Wat gebeurt er nadat het DNA is gesequenced?
Vervolgens worden de frequent voorkomende varianten (>1% van de populatie) weg gefilterd. Met software programma’s kan men de resterende varianten verder interpreteren. Er wordt dan aangegeven wat de consequentie van een variant is op eiwitniveau: of de aminozuur volgorde verandert (missense variant), er een vroege stop ontstaat (nonsense variant) of er een frameshift optreedt (een verkeerd leesraam), waardoor er geen functioneel eiwit meer gemaakt kan worden. Na filtering van de varianten, verdere interpretie/classificatie en eventueel passend overervingspatroon heeft men meestal het aantal varianten teruggebracht tot een beperkt aantal kandidaatgenen, waarna men kan proberen een diagnose te stellen, in het bijzonder in genen waar reeds een ziektebeeld bij is beschreven.
