ZO 9.4 Nieuwe ontwikkelingen in de genetica Flashcards
Hoeveel aangeboren afwijkingen verwacht je bij een chromosoomafwijking en hoeveel verwacht je er bij een puntmutatie of deletie van één gen?
In het algemeen vertonen patiënten met een chromosoomafwijking een aantal verschillende aangeboren afwijkingen. Ook bij een puntmutatie of deletie van één gen kunnen meerdere aangeboren afwijkingen in één individu worden waargenomen.
Wat pikt een SNP-array op?
Een verandering van het normaal aantal kopieën van genen, ook wel een copy number variation (CNV) genoemd, kan met een SNP array opgepikt worden.
Hoe werkt SNP-array?
Een SNP array is een drager waarop in hoge dichtheid korte stukjes DNA (oligo’s) gespot zijn. Deze oligo’s liggen over het hele genoom verspreid, maar bepaalde (vaak minder informatieve) regio’s zoals de centromeren worden uitgesloten. Door, na hybridisatie op het DNA, naast de oligo’s een fluorescente nucleotide in te bouwen is naast de informatie over het aantal kopieën ook zichtbaar of het DNA homozygoot of heterozygoot voor een SNP (single nucleotide polymorfisme) op die positie is.
Hoe lees je een SNP-array af?
De GSA-24 v3.0 SNP array, een veel gebruikte diagnostische SNP array, bevat ruim 600.000 SNPs verdeeld over de 22+XY chromosomen. In figuur 1 zijn alle chromosomen weergegeven (links chromosoom 1 en uiterst rechts chromosoom Y). In het bovenste gedeelte van het plaatje zien we de Log2 ratio (ook LogR genoemd). Dit geeft het aantal kopieën weer (normaal (2n)=0, extra= + en verlies = –). In het onderste gedeelte van figuur 1 is de B-Allel Frequentie (BAF) (zie tekst blok en figuur 2) uitgezet (1=homozygoot: BB =100% ; 0.5=heterozygoot: AB =50% en 0= homozygoot: AA=0%). Als de LogR omhoog gaat zijn er meer kopieën, als de LogR omlaag gaat zijn er minder kopieën.
Hoe kun je de B-allel frequentie interpreteren?
B-allele Frequency (BAF) Met de SNP informatie op de arrays wordt de BAF, de frequentie van het “B” allel, bepaald. In diploïde DNA zijn AA, AB, en BB allelen mogelijk. Bij verlies van een allel blijft alleen een A of B allel over. Bij winst is er een extra kopie aanwezig en zien we de 3 allelen in 4 combinaties: BBB, BBA, BAA en AAA (Figuur 2).Figuur 2: B-allel frequentie in het geval van 3 allelen (in het geval van een duplicatie).
Hoe werkt de B-allelfrequentie?
Bij verlies van een chromosoom of gedeelte van een chromosoom houdt men nog maar één allel over: de LogR waarde daalt naar -0.5 en er is sprake van 100% B of 0% B (=100% A) in de B-allel frequentie. Bij winst is er sprake van extra materiaal: de LogR waarde stijgt naar +0.37 (van 2 naar 3 kopieën) en bij de BAF komt er een extra allel bij: 100% BAF: BBB; 66% BAF: BBA, 33% BAF: BAA; en 0% BAF: AAA.
Leiden copy number afwijkingen altijd tot pathologie?
Sommige kleinere copy number afwijkingen worden ook in de normale gezonde populatie gevonden en zijn onschuldige polymorfismen. Van andere deleties of duplicaties is bekend dat ze ziekte veroorzakend zijn. Deze copy number afwijkingen zijn meestal groter dan de bekende polymorfe gebieden. Zie hier onder nog enkele voorbeelden.
Wat is aneuploïdie?
Wanneer een volledig chromosoom een copy number afwijking vertoont spreekt men van aneuploïdie. Aneuploïdie duidt op de aanwezigheid van meer of minder dan het normale aantal van 46 chromosomen (=2n) in de celkern.
Wat is polyploïdie?
Polyploïdie is het voorkomen van een of meer extra set(s) haploide (n) chromosomen in de celkern, bijvoorbeeld na een dubbele bevruchting (3n=69 chromosomen) of als gevolg van het uitblijven van de celdeling na de kerndeling (4n=92 chromosomen).
Welke aneuploidieën zijn als enige levensvatbaar?
De enige levensvatbare autosomale aneuploidieën zijn trisomieën van de chromosomen 13, 18 en 21 die leiden tot resp. Patau, Edwards en Down syndroom. Levensvatbare aneuploidieën van de geslachtschromosomen zijn bijvoorbeeld monosomie X (45,X: Turner syndroom), trisomie X (XXX: triple X), disomie Y (XYY male) en een extra X chromosoom (XXY: Klinefelter syndroom).
Hoe ontstaan aneuploidieën?
Aneuploidieën ontstaan ten gevolge van een onjuiste verdeling van de chromosomen (non-disjunctie) tijdens de kerndeling (mitose/meiose). Als gevolg van non-disjunctie heeft na de kerndeling één van de twee dochtercellen een chromosoom te veel (2n+1=47 in het geval van mitose en n+1=24 in het geval van meiose). De andere dochtercel heeft dan een chromosoom te weinig (2n-1=45 in het geval van mitose en n-1=22 in het geval van meiose; zie figuur 4). Deze dochtercel gaat meestal verloren als gevolg van apoptose.
Hoort dit profiel bij een mannelijke of vrouwelijke patient? Is er sprake van een aneuploïdie en zo ja, welke?
Trisomie 21, man.
Wat zijn de LogR en BAF waardes van dit chromosoom en hoe vertaalt dit zich tot een of meer extra kopieën?
De LogR waarde is net iets lager dan 0.5, daarmee is er 1 extra kopie van chromosoom 21 . Bij 2 extra kopieën (48,XY,+21,+21) zou dit hoger zijn. De BAF toont waardes bij 0 en 1.0, maar ook rond 0.35 en 0.65, passend bij de aanwezigheid van 1 extra kopie.
Kan met deze vorm van SNP array diagnostiek worden vastgesteld of er sprake is van een mozaïek-patroon? Zo ja, hoe zou dat er dan uitzien. Zo nee, waarom niet?
Ja dan zou echter de logR wat lager liggen, en de BAF ook anders liggen. Bv bij 50% mozaïcisme (46,XX[50%]/47,XX,+21[50%]) ligt de BAF bij heterozygote allelen bij 40/60%.
Kan met een SNP array worden vastgesteld of er sprake is van een erfelijke vorm van de aandoening, bijvoorbeeld door een Robertsoniaanse translocatie? Een Robertsoniaanse translocatie is een fusie van een acrocentrisch chromosoom met een ander acrocentrisch chromosoom (13, 14, 15, 21 en 22)?
Nee, met SNP array kan alleen verlies of winst van materiaal worden aangetoond, maar is niet duidelijk op welke manier dit verlies of winst aanwezig is. Het verlies van de p-armen van deze acrocentrische chromosomen is niet te detecteren omdat er geen probes op de korte p-armen van deze chromosomen liggen. Bij een ongebalanceerde Robertsoniaanse translocatie zal daarom alleen winst van chromosoom 21 zichtbaar zijn op array. Bij een gebalanceerde Robertsoniaanse translocatie is er geen sprake van verlies van coderend materiaal en zie je een normaal arrayprofiel. In Figuur 6 zie je een voorbeeld van een dergelijke translocatie (tussen chromosoom 13 en 14 in dit geval).
In figuur 7 zijn de LogR waarden en BAF van verschillende numerieke chromosoom X afwijkingen weergegeven. Panel 1, 3, 5 en 7 geven het normale vrouwelijk patroon, met twee X verschillende allelen weer: XX. Panel 2, 4 en 6 zijn afwijkend: Bestudeer de LogR waarden en BAF in de afwijkende panels.
Rechts van de figuur zie je 3 pijlen die de verschillende logR waarden aangeven. Hoeveel kopieën van chromosoom X zou je verwachten bij de logR waarden die horen bij A, B of C?
- A: 3
- B: 2
- C: 1
In figuur 7 zijn de LogR waarden en BAF van verschillende numerieke chromosoom X afwijkingen weergegeven. Panel 1, 3, 5 en 7 geven het normale vrouwelijk patroon, met twee X verschillende allelen weer: XX. Panel 2, 4 en 6 zijn afwijkend: Bestudeer de LogR waarden en BAF in de afwijkende panels.
En welke B-allel frequenties zie je weergegeven in onderstaande panels?
- Panel 1 (als voorbeeld): AA, AB en BB
- Panel 2 (als voorbeeld): AA en BB. AB is hier afwezig.
- Panel 4: AA en BB, AB is hier afwezig
- Panel 6: Hier zijn in totaal 3 allelen: AAA, AAB, ABB en BBB.
- Panel 7: Als 1, dus AA, AB en BB
Wat is het geslacht van deze patiënt?
Vrouw
Bij deze patiënt is er sprake van een chromosoomafwijking waarbij chromosoom 5 en 6 betrokken zijn. Omschrijf de afwijking en teken de afwijkende chromosomen (teken behalve de twee afwijkende chromosomen ook de twee homologe normale chromosomen, zie voorbeeld hieronder).
Bij patiënt is sprake van een ongebalanceerde translocatie, waarbij een deel van chromosoom 5 aan chromosoom 6 is “geplakt”. Hierbij ontstaat een tekort van (een deel van) chromosoom 5, en een teveel aan (een deel van) chromosoom 6. Er is daarom sprake van een zgn. derivaat chromosoom 5 opgebouwd uit een translocatie tussen chromosomen 5 en 6: der(5)t(5;6)(p14.3;p24).
Stel dat de moeder van deze patiënt draagster is van de gebalanceerde vorm van deze chromosoomafwijking. Teken in figuur 9 de homologe chromosomen van de moeder die betrokken zijn bij de gebalanceerde afwijking.
Welke chromosoom combinaties kan ze doorgeven aan haar eventuele nakomelingen en wat verwacht je van deze combinaties?
In een kwart van de nakomelingen zijn de normale chromosomen 5 en 6 doorgegeven, in een kwart van de nakomelingen heeft moeder beide derivaatchromosomen doorgegeven, dus een gebalanceerde translocatie. In de helft van de nakomelingen komt een ongebalanceerde translocatie voor: soms met verlies van chromosoom 5 en winst deel chromosoom 6 (derivaat chromosoom 5 met normaal chromosoom 6) en omgekeerd, soms extra chromosoom 5 en verlies van chromosoom 6 materiaal (normaal chromosoom 5 met derivaat chromosoom 6).
Wanneer is een fenotype bij de moeder te verwachten?
Je verwacht bij moeder geen fenotype, de translocatie is immers gebalanceerd. Maar, als de translocatie door een gen gaat en een effect heeft op de hoeveelheid of structuur van het gen product, kan ook in de gebalanceerde situatie een fenotype ontstaan.
Hoe werkt NGS?
Met behulp van NGS (Next generation sequencing) kan binnen één experiment van een grote hoeveelheid genomisch DNA de nucleotide volgorde bepaald worden (sequencen). Hiervoor fragmenteert men het genoom in kleine DNA fragmenten die vervolgens m.b.v. speciale technologie base voor base afgelezen worden. Om tijd en geld te besparen kan men alleen die fragmenten isoleren waar men in geïnteresseerd is (DNA capture), bijvoorbeeld alle 22.000 coderende gengebieden (ook wel een exoom genoemd, ~1% van het totale DNA). Na deze selectie worden de DNA fragmenten geamplificeerd en wordt van beide uiteinden een circa 100 basen lange DNA volgorde bepaald. Op deze manier worden enorme aantallen korte DNA sequenties van ~100 bp lang geproduceerd, de zgn reads.
Deze fragmenten worden weer teruggeplaatst op het referentiegenoom (mapping) en de verschillen t.o.v. dit referentie genoom genoteerd (variant calling). Dit referentie genoom is een “bevroren” internationaal gebruikte humane DNA referentie. Vervolgens worden de gevonden varianten gefilterd en het effect van de variant bepaald (classificeren). Voor een betrouwbare analyse heeft men een minimum aantal reads op een te onderzoeken positie nodig. In de regel geldt, dat hoe meer van het genoom er bekeken wordt, hoe lager het aantal reads per positie is. Gemiddeld worden 100.000 varianten per exoom gevonden.
Wat gebeurt er nadat het DNA is gesequenced?
Vervolgens worden de frequent voorkomende varianten (>1% van de populatie) weg gefilterd. Met software programma’s kan men de resterende varianten verder interpreteren. Er wordt dan aangegeven wat de consequentie van een variant is op eiwitniveau: of de aminozuur volgorde verandert (missense variant), er een vroege stop ontstaat (nonsense variant) of er een frameshift optreedt (een verkeerd leesraam), waardoor er geen functioneel eiwit meer gemaakt kan worden. Na filtering van de varianten, verdere interpretie/classificatie en eventueel passend overervingspatroon heeft men meestal het aantal varianten teruggebracht tot een beperkt aantal kandidaatgenen, waarna men kan proberen een diagnose te stellen, in het bijzonder in genen waar reeds een ziektebeeld bij is beschreven.
Doen we bij NGS altijd het gehele genoom?
Vaak worden tijdens een analyse van NGS data niet het volledige exoom (alle genen) bekenen, maar wordt er bioinformatisch gefilterd op genen passend bij de aanvraagindicatie (genpanel). Dit zorgt voor een snellere analyse en verkleint de kans op een zgn. nevenbevindingen (het vinden van een variant/diagnose die buiten de medische vraagstelling valt).
Wat gebeurt er bij een trio-analyse?
Bij een zgn. trio-analyse (hierbij wordt DNA van kind en ouders bekeken) maakt men gebruik van de beschikbare genetische informatie zoals het verwachte overervingspatroon van een aandoening (recessief of dominant) en selecteert men alleen die varianten die passen bij een verwacht overervingspatroon. Bij veel aandoeningen is een variant nieuw ontstaan (de novo). In het geval van een recessieve aandoening verwacht je een homozygote variant in het kind en heterozygotie bij beide ouders.
Wat wordt er gedaan als er bij NGS een DNA variant wordt gevonden waarvan de betekenis onduidelijk is?
Bij NGS wordt met regelmaat een DNA variant gevonden waarvan de betekenis onduidelijk is (een zogenaamde “variant met onbekende klinische betekenis”). Indien gewenst kan het effect van deze variant verder worden bestudeerd, bijvoorbeeld op RNA splicing. Ook kan de variant worden nagemaakt in een cellijn of muismodel, om zo het effect van die variant of de functie van het betrokken eiwit verder te kunnen bestuderen.
Wat zijn de voor- en nadelen van een volledig exoom (alle genen) & filtering op een panel (selectie van genen), wat betreft:
- De kosten;
- Het vinden van mutaties in andere klinisch relevante genen die niets met de aandoening te maken hebben, de zgn. nevenbevindingen;
- Het vinden van nieuwe kandidaat-genen.
A. Exome sequencing is (nog) goedkoper dan whole genome sequencing (voordeel van exome sequencing tov whole genome), met name omdat je bij laatstgenoemde meer data genereert.
B. Bij exome sequencing is de kans op een nevenbevinding groter, je bekijkt immers alle genen incl genen die niet per se relevant zijn voor de klinische vraagstelling. Dit is daarom een nadeel van exome sequencing tov een panel, nevenbevindingen zijn ongewenst.
C. Het vinden van nieuwe kandidaatgenen kan alleen bij een volledig exoom. Hierbij worden alle genen bekeken, ook de genen waarvan nog geen functie of ziektebeeld bekend is. Bij een volledig exoom wordt breder gekeken, dus is de kans op het vinden van kandidaat genen groter (voordeel).
Paren die genetisch verwant aan elkaar zijn hebben een verhoogd risico op het krijgen van het kind met een (zeldzame) genetische aandoening. Indien beide ouders drager zijn van een zeldzame variant betrokken bij een autosomaal recessieve aandoening, kan dat resulteren in een homozygote variant bij nakomelingen (Figuur 12). Het aangedane kind heeft vermoedelijk een autosomaal recessieve aandoening. Na informed consent hebben we besloten om de indexpersoon (het aangedane kind, ingekleurd) en beide ouders te sequencen met exoom sequencing. In tabel 1 ziet u een aantal varianten (na een groot aantal bewerkingen, ondermeer het weg filteren van de normale variaties).
Welke varianten blijven over als uitgegaan wordt van een recessieve aandoening?
1, 5, 6, 8, 10, 11 en mogelijk 4
Een aantal varianten blijven over en zijn kandidaten voor follow-up: voor welke zou je kiezen en waarom?
Je selecteert in dat geval de varianten uit antwoord 13 (deze passen bij de overerving), maar filtert dan verder op een (mogelijk) effect dat eiwit functie verstoort: De meest belovende kandidaten zijn varianten 6 en 10 (want beide stops) en mogelijk 4, 5, 8, 11. Voor variant 1 wordt geen effect voorspeld.
Van varianten 5 en 8 zijn deficiënte muismodellen bekend. Het fenotype van deze muizen lijkt totaal niet op dat van de patiënt. Hoe zou je de NGS resultaten van deze varianten nu interpreteren?
Dat deze varianten waarschijnlijk geen oorzakelijk verband hebben met het fenotype van de patiënt.
De ouders hebben in hun consent aanvraag aangegeven alle klinisch relevante informatie van henzelf en hun kind te willen weten. Nu is een van de varianten (variant 9) een mutatie in het BRCA1 gen wat een sterk verhoogd risico voor borstkanker geeft. Heeft deze klinische consequenties voor de dragers? En zou je dat rapporteren aan de familie? Waarom wel of waarom niet?
Beide dragers zijn mannen: dus een directe consequentie zal dit voor hen niet hebben, wel voor zussen van vader en dochters. Afhankelijk van wat de ouders hebben ingevuld: als ze alles willen weten: dan wel. Met een juiste voorlichting en vooraf bespreken van deze mogelijke niet aan de ziekte van de patiënt gerelateerde bevindingen en wensen van de ouders kan men deze problemen voorkomen.
Hoe werkt de NIPT?
NIPT wordt uitgevoerd op bloed van de zwangere dat vrij circulerend DNA bevat van de moeder en foetus. Uit 20-30 ml bloed worden alle cellen verwijderd en uit het overgebleven plasma wordt vrij circulerend DNA geïsoleerd. Dit DNA komt vnl. van de moeder en slechts een klein gedeelte (5-20%) is afkomstig van de foetus. Het cel vrije DNA wordt gesequenced en de reads worden terug gemapped op de chromosomen en geteld. De coverage is ongeveer 0,2-0,4 x het genoom (zgn. shallow sequencing) en de DNA sequentie wordt alleen gebruikt om de DNA fragmenten te kunnen mappen op een specifiek chromosoom. Na het bepalen van het aantal reads per chromosoom wordt met diverse statistische methodes (Z-score, Wisecondor, read-depth) bepaald of deze waarde afwijkt van het normale patroon met behulp van het referentie cohort van normale zwangerschappen. Indien er sprake is van een trisomie zullen er van dat chromosoom meer reads aanwezig zijn. Naarmate er meer foetaal DNA aanwezig is zal de relatieve hoeveelheid van het afwijkende chromosoom verder toenemen (figuur 15). Het proces van bloedafname tot uitslag duurt ongeveer 3 weken.
Een afwijkende NIPT wordt altijd bevestigd dmv een vlokkentest of vruchtwaterpunctie. Waarom is dat?
De NIPT meet DNA afkomstig uit de placenta, we doen een aanname dat dit DNA hetzelfde is als het DNA van het kind, maar dit is niet altijd zo: Soms bevat de placenta afwijkingen die NIET in de foetus terug te vinden zijn (een zgn. Confined Placental Mozaïsm). Daarom wordt een afwijkend NIPT resultaat bevestigd in materiaal dat dichter bij de foetus staat (vruchtwater of vlok), om een vals positief resultaat uit te sluiten.
De tijd tussen afname van het bloed en isoleren van het cel vrije DNA wordt zo kort mogelijk gehouden. Ook worden er vaak speciale buizen gebruikt die afbraak van het bloed tegen gaan. Wat zijn hiervoor de redenen?
Men streeft er naar de tijd tussen bloed afnamen en de isolatie van het foetale DNA zo kort mogelijk te houden. Als dit te lang duurt kunnen er meer maternale cellen stukgaan en is er dus relatief meer maternaal celvrij DNA en minder foetaal celvrij DNA aanwezig. Met speciale buizen (zgn Streck buizen) die vnl de cellen in het bloed heel houden zou bv een langere tijd tussen bloed afname en DNA isolatie minder effect hebben.
Zie figuur 16: Wanneer kan een NIPT test worden ingezet? En wat zou de meest optimale tijd zijn ?
Technisch gezien maakt het niet zoveel uit, het niveau blijft vrij constant. Wel probeert men zo snel mogelijk een uitslag te genereren zodat een eventuele afbreking zo vroeg mogelijk (in ieder geval voor de 24e week) kan plaatsvinden.
