Patología Molecular Flashcards
Para qué sirve la patología molecular
Diagnóstico de enfermedades
Conocer respuesta a tratamientos
Progresión de la enfermedad
Indicador del estado biológico que predice y modifica respuesta a tratamientos y pronostican tiempo de vida
Biomarcador
Tipos de diagnósticos moleculares
Genético
Enfermedades infecciosas
Qué detecta el diagnóstico molecular genético
Locus para conocer el desarrollo de enfermedades
Pruebas de diagnóstico molecular genético
FISH
PCR
Secuenciación de ADN
Qué es la hemocromatosis primaria
Enfermedad donde se elevan los niveles de hierro en hígado e intestino
Por qué se genera la hemocromatosis primaria
Mutación gen HFE 6p
Qué detecta el diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas
Genoma del microorganismo
Pruebas de diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas
PCR
Secuenciación de ADN
La mutación de qué gen afecta el crecimiento celular
RAS
Marcador de resistencia frente a mutación de gen RAS
Anti-EGFR
Proteína que desbloque la respuesta de los linfocitos
PD-L1
Función de la PCR
Amplificar un segmento de ADN para sintetizarlo
Con qué se mezcla el ADN en la prueba PCR
Cloruro de magnesio
Taq polimerasa
Primers
Deoxinucleotidos
Buffer
Coadyuvantes
Componente de la mezcla de PCR que es resiste a las altas temperaturas
Taq polimerasa
Función de los primers
Delimitar región de ADN de interés
Función de los deoxinucleotidos
Ladrillos de construcción que crean la cadena análoga
Función del buffer
Ayudar a mantener el pH
Ciclo de la PCR
- Desnaturalización
- Anillamiento
- Extensión
Qué es la desnaturalización
A 94° se separan las cadenas de ADN
Qué es el anillamiento
A 62° primers se pegan a su objetivo
Qué es la extensión
A 62° taq polimerasa pega los nucleótidos y hace copia de la hebra
Cuántas veces se repite el ciclo de PCR
20-30
Qué es RT-PCR
PCR inversa
Cómo actúa la PCR inversa
A partir de ARN se crea cADN
Qué es qPCR
PCR en tiempo real
Qué es RT-qPCR
PCR cuantitativa
Qué es mpPCR
PCR múltiple
Cómo actúa la PCR múltiple
Usa múltiples primers para generar varias copias por ciclo
Tipos de secuenciación del ADN
Método Sanger
NGS
Cómo funciona la secuenciación de ADN por el método Sanger
Secuenciación con síntesis de la molécula utilizada
Molécula que provoca terminación de la síntesis de cadena en el método Sanger
Didesoxinucleótidos trifosfatos
Qué grupo está ausente en los didesoxinucleótidos trifosfatos
OH
Tipos de secuenciación de la siguiente generación (NGS)
Sanger automatizado
Ilumina
Ion conductor
Tercera generación / tiempo real
Cómo se hace la secuenciación en un Sanger automatizado
Por síntesis o polimerización
Cómo funciona la secuenciación de ADN por Ilumina
Síntesis con fluorescencia y terminadores reversibles para secuencias cortas
Pasos de la secuenciación de ADN con Ilumina
- Preparación
- Amplificación cíclica
- Generación clústeres
- Amplificación clonal
- Secuenciación
- Análisis de datos
Qué pasa en la preparación de la secuenciación de ADN con Ilumina
Se fragmenta ADN con transposasas y se hace tagmentación
Qué es tagmentación
Adición de secuencias adaptadoras al ADN
Qué pasa en la amplificación cíclica de la secuenciación de ADN con Ilumina
Primers se unen a cada lado adicionando índices y regiones complementarias
Qué pasa en la generación de clústeres de la secuenciación de ADN con Ilumina
Fragmentos de ADN entran a nanopozos donde se amplifican y unen a la región complementaria con la polimerasa
Qué pasa en la amplificación clonal de la secuenciación de ADN con Ilumina
Cadena original se desnaturaliza y la copia se dobla y hace amplificación en puente para formar hebra forward y reverse
Qué pasa en la paso de secuenciación de la secuenciación de ADN con Ilumina
Síntesis de cadena forward y reverse con fluorocromo
Cómo se hace el análisis de datos de la secuenciación de ADN con Ilumina
Comparando con genoma de referencia
Cómo funciona la secuenciación de ADN por Ion conductor
Secuenciación en tiempo real según los cambios en el pH
Pasos de la secuenciación de ADN con Ion conductor
- Preparación
- Perlas
- Secuenciación por síntesis
- Análisis de datos
Qué pasa en la paso de preparación de la secuenciación de ADN con Ion conductor
Adición de adaptadores para el fácil fraccionamiento de ADN
Qué pasa en la paso de preparación de la secuenciación de ADN con Ion conductor
Emulsión rodea todo el contenido y las polimerasas rodean con cadenas
Qué pasa en la paso de secuenciación por síntesis de la secuenciación de ADN con Ion conductor
Se adiciona silicio que cuando se complementa la hebra en el micropozo con su nucleótido envía señal
Por qué la unión entre la hebra y el nucleótido en la secuenciación de ADN con Ion conductor detecta un cambio en el pH
Liberación de protones por la unión cambia pH hasta ser ácido
Tipos de secuenciación de ADN de tercera generación / tiempo real
PacBio
Nanoporos
Par qué tipo de secuencias se utiliza la secuenciación de ADN de tercera generación/tiempo real
Secuencias largas
Cómo funciona la secuenciación por PacBio
Síntesis acoplada a fluoruro con detección en tiempo real
Cómo funciona la secuenciación por nanoporos
Enzimas se asocian para dirigir hebra por poro
Proteína que conforma el poro en la secuenciación de ADN por nanoporos
Alfa hemolisina
Función de la alfa hemolisina
Dividir el poro en vestíbulo y constricciones
Iones presentes al interior del poro
Cis = ánodo
Trans = cátodo
Qué puede interrumpir el flujo de iones por el poro
Bases nitrogenadas
Proteína que direcciona la hebra a través del poro en la prueba nanoporos
Hairpin (mitad)
Proteína motora (comienzo)
Qué se le adiciona a la hebra en la técnica nanoporos
Adaptador líder y de arrastre
Orden del paso de la hebra a través del poro en la técnica nanoporos
- Adaptador líder
- Hebra líder
- Hairpin
- Hebra complementaria
- Adaptador arrastre
En qué se basan los chips de ADN o Microarreglos
ADN se inserta en un chip con fluorescencia que es específico a la necesidad
Qué se analiza en los chips de ADN
Genoma
Transcripción
Proteínas
Formas en las que se puede realizar un microarreglo
Spotted (sonda)
In situ (fotolitografía = exposición)
Cuando hay un solo canal en el microarreglo sobreexpresado que significa
Anormalidad celular
Resultados que puede haber cuando en un microarreglo hay dos colores que compiten por su expresión
Sobreexpresión = cADN problema
Sin cambios = no hay diferencia
Subexpresión = cADN control
Qué es FISH
Hibridación con Fluorescencia In Situ
Qué permite realizar una prueba FISH con una muestra fijada
Detectarla
Localizarla
Cuantificarla
Qué tipo de hebra forma una prueba FISH
Molécula híbrida de ADN + ARN
Qué utiliza FISH para revelar la cadena de ADN
Fluorescencia
Qué utiliza CISH para revelar la cadena de ADN
Cromógenos
Qué se examina en una biopsia líquida
ADN libre en el plasma de una muestra de snagre
Qué es cfADN
ADN normal
Qué es ctADN
ADN tumoral
Cómo está conformado el ADN libre
Tumoral + Normal
Cuando se incrementa la carga tumoral del ctADN
Situaciones de estrés
Cuáles son las ventajas de una biopsia líquida
Perfila tumores de difícil localización
Monitorea los residuos tumorales
Evalúa respuesta a tratamientos
Detecta alteraciones genéticas (terapias)
Cuál es la principal desventaja de una biopsia líquida
No siempre hay la suficiente cantidad de ctADN
Función de la citometría de flujo en la patología
Diagnóstico
Clasificación
Pronóstico
Células que se pueden detectar en una citometría de flujo
Cancerosas
Tumorales
Qué analiza con fluorescencia la citometría de flujo
Funciones celulares
Para qué sirve la citometría de flujo
Identificar y separar poblaciones celulares = purificar y trasplantar células
De qué determina la cantidad la citometría de flujo dentro de las células
ARN
ADN
