Proteomics, metabolomics, miRNA;s en RNAi screens Flashcards
proteomics
bestudeert alle eiwitten van de cel.
Massaspectromie
- eiwit of eiwitmengsel
- trypsine digestie
- analyse met massaspectrometrie
- data vergelijking (humaan genoom project)
- identificatie van het eiwit
gebruik massaspectrometrie
- Eiwit identificatie
- Eiwit kwantificeren (iets moeilijker)
- Bindende eiwitten identificeren
- Eiwitmodificaties identificeren (fosforylering, acetylering, methylering, etc.)
massaspectrometrie eiwit-interacties
Er kan gekeken worden naar eiwit van interesse. Dit kan gedaan worden door het ontwikkelen voor een eiwit waarin je de interactie wilt onderzoeken. Als je dit antilichaam toevoegt, zal het eiwit van interesse daaraan binden. De eiwitten die niet hebben gebonden worden weggewassen. De eiwit interacties kunnen in kaart geworden door massaspectrometrie
eiwitmodificaties identificeren
Eiwitmengsel trypsine digestie verrijk voor fosfopeptiden identificeer mbv massa spectrometrie. De eerste piek is een eiwit zonder fosfaatgroep en de tweede piek is hetzelfde eiwit met fosfaatgroep (zwaarder). Kijkend naar de moleculaire massa van een peptiden kan worden achterhaald welke peptiden gefosforyleerd zijn. Hetzelfde kan gedaan worden bij toevoeging van andere groepen
metabolomics
analyseert welke metabolieten er voorkomen
Kan metabolomics aanwijzing zijn voor aanwezigheid van tumor?
- De aanwezigheid van bepaalde metabolieten kan mogelijk worden gebruikt in de vroege detectie van tumoren. Één van de hallmarks van tumoren is deregulering van energievoorziening. Een tumor maakt metabolieten die normaal niet in grote hoeveelheden gemaakt worden.
Stappen voor het in kaart brengen voor metaboloom
- Sample preparation: eventueel zuiveringsstap
- Massaspectrometrie
- Identificatie mbv computer
- Herkennen van patroon
- Bepalen biomarker
metabolieten
zijn al kleine moleculen, ze kunnen positief worden geladen en tegen een plaat aan vliegen (massaspectrometrie). Kunnen worden geidentificeerd en een patroon kan worden herkend (tumor vroeg opsporen).
Waarom is mRNA niet altijd voorspellend voor eiwitactiviteit
regulatie van eiwitmodificaties, eiwitstabiliteit en translactie
transleren miRNA
- Van het DNA wordt een stuk RNA afgeschreven, het primaire micro-RNA.
- Dit wordt op maat geknipt door Drosha pre-miRNA
- Transport vanuit nucleus naar cytoplasma
- Dicer knipt het complex tot miRNA (kort stukje dubbelstrengs RNA)
- Één streng wordt ingebouwd in het RISC-complex. In dit complex kan het weer binden aan een complementaire sequentie in het mRNA.
- De miRNA zorgt voor specificiteit. Eiwitcomponenten zorgen voor repressie van translatie of voor meer mRNA afbraak.
belang miRNA voor kanker
- Bijna de helft van alle onderzoek richt zich op kanker
- Meerdere voorbeelden van directe beïnvloeding van kanker gerelateerde genen
miR16
komt verlaagd tot expressie in een aantal tumoren. Als er minder miR16 is wordt BCL2 verhoogd > apoptose geremd. Daarnaast zorgt verlaging van mir16 ook tot verhoging van CDC25A, wat weer leidt tot celcyclus progressie.
miRNA expressie en diagnose
- microRNA microarrays kunnen de expressie van honderden miRs tegelijkertijd bepalen
- Dit kan ook met NGS
- Dit kan net als mRNA expressieprofielen geanalyseerd worden
- Goede diagnostische en prognostische waarde
- Combinatie met mRNA microarrays/sequencing, proteomics en metabolomics geeft zeer veel informatie
- Alle technieken duur, dus uiteindelijk zal voor een relatief goedkope combinatie gekozen worden, nog niet duidelijk welke dit zal worden.
gebruik siRNA in onderzoek
siRNA is RNA wat de cel ingebracht wordt. Het RISC complex zal het dubbelstrengs RNA in stukken gaan knippen. Vervolgens kan het complex mRNA afbraken.
