VO's week 4 Flashcards
Wat is RNA-polymerase II?
RNA polymerase II is het enzym dat de transcriptie van eiwit-coderende genen uitvoert. Het is afhankelijk van hulp-eiwitten, transcriptie-factoren.
Hoe werken algemene transcriptiefactoren van het RNA polymerase II?
Ze binden eerst aan de promoter, waarna het RNA polymerase II bindt.
Op welke plek in het DNA kunnen we de promotor van een gen vinden?
Direct voor het punt waar de transcriptie van het gen begint. Promotor heeft een vaste positie, upstream van de transcriptie. Hieraan binden algemene transcriptiefactoren.
Waaruit bestaat een enhancer element?
een basevolgorde in het DNA, aan de enhancer binden specifieke factoren. Bepalen de hoeveelheid van expressie, waar en wanneer
Op welke plek in het DNA kunnen we de enhancer van een gen vinden?
Kan voor of achter de promotor zijn, het is altijd op hetzelfde chromosoom. De plek van de enhancer kan variëren. Ze loopen naar de promotor als ze ver weg zijn, als de enhancer dichtbij zit is het niet nodig.
Ergens in een gen is een mutatie opgetreden waardoor het mRNA langer dan normaal is geworden maar het eiwit korter dan normaal.
Welke mutatie kan in aanmerking komen (langer mRNA, maar toch een korter eiwit)?
Splice donor mutatie, bij een donor mutatie komt er een intron bij in het mRNA
Welke splice mutaties zijn er?
Mutatie van een spliceplaats, waardoor deze niet meer kan functioneren en resulteert in verlies van een exon (fout in acceptor site) of het niet uitknippen van een intron (fout in donor site).
Uit tumorcellen wordt genomisch DNA geïsoleerd en met behulp van de PCR methode geanalyseerd.
Vier specifieke primers zijn:
(1) een voorwaartse primer van exon 1
(2) een terugwaartse primer van intron 1
(3) een terugwaartse primer van exon 2
(4) een voorwaartse primer van exon 2
Welke combinatie van 2 primers kan gebruikt worden voor deze analyse?
1 en 2, 1 en 3, 3 en 4.
Welke moleculaire genetische technieken zijn er?
- Analyse van DNA: FISH, PCR, sequencing
- Analyse van RNA: RNA blot, RT-PCR (kopie van mRNA, naar DNA, met behulp van reverse transcriptase, hiervan kun je een PCR doen)
- Analyse van eiwitten: Westernblot, immunokleuring
Wat zijn de kenmerken van PCR?
Het is extreem gevoelig en je hebt zeer kleine hoeveelheden DNA nodig.
Waarvoor gebruiken we PCR?
- Opsporen van translocaties
- Meten van mismatch repair (MMR) activiteit
Wat is westernblotting?
eiwit analyse met specifieke antilichamen
Welke informatie kun je verkrijgen met westernblotting?
- Grootte van het eiwit (plaats van de band)
- Hoeveelheid van het eiwit (dikte van de band): hoe dikker de band hoe meer eiwit.
- Modificaties (bv fusie eiwitten door chromosomale translocaties): bv een extra band die je niet had verwacht.
Wat is een immunoblot?
Een immunoblot is een biochemische techniek waarmee een specifiek eiwit in een mengsel van eiwitten door middel van antilichamen gedetecteerd kan worden. In het algemeen worden de eiwitten in het eiwitmengsel eerst gescheiden op basis van hun grootte of beter gezegd, moleculair gewicht door middel van een gelelektroforese. Vervolgens worden de eiwitten die gescheiden zijn op grootte van de gel “overgebracht” naar een nitrocellulose- of PVDF-membraan waar ze vervolgens aan hechten. Dit proces wordt blotten genoemd.
Twee verschillende probes voor het BCR-gen: De voorkant van het BCR-gen (5’-bcr) en de achterkant van het BCR-gen (3’-bcr) gebruikt.
cABL verhuist van chr. 9 naar chr. 22. Hoe staat het met het BCR-gen?
5’ BCR blijft op chr. 22 en 3’ BCR gaat naar chr.9. Het enige stuk BCR dat bij ABL is, is het begin van BCR. Die kleur je dus aan met 5’BCR. Het Philadelphia chromosoom bestaat uit de promotor en een paar exonen uit BCR en exonen en intronen uit ABL.
Hoe zou het 8.5kb mRNA bij de patiënt verklaard kunnen worden?
fusie mRNA BCR-ABL
Er werd een mengsel gebruikt van drie specifieke primers:
(1) een voorwaartse primer van een 5’ coderend gebied van BCR
(2) een terugwaartse primer van een 3’ coderend gebied van BCR
(3) een terugwaartse primer van een coderend gebied in ABL
Welke combinatie van primers zijn verantwoordelijk voor PCR- product 1 en welke voor product 2?
product 1: 1 en 2, product 2: 1 en 3
Bij patiënt 1, 2 en 6 heeft PCR-product 2 dezelfde lengte. Hoe kan dat? Wat zou er aan de hand zijn bij patiënt 5?
Omdat de DNA breuk in hetzelfde intron heeft plaatsgevonden. Het DNA breekt vaak op hetzelfde punt omdat het daar gevoeliger is voor dubbelstrengsbreuken. Patiënt 5 kan een extra exon bevatten.
Wat is het gevolg van een t(14;18) bij een folliculair B-cel lymfoom?
Het gevolg van de translocatie is dat het BCL2-gen (gelegen op chromosoom 18q) nu in de nabijheid komt te liggen van de enhancer van het IgH gen op 14q32, dat codeert voor de zware ketens (heavy chain) van de immuunglobulinen. De expressie van het BCL2-gen komt dan onder controle van de IgH enhancer. De IgH-enhancer stimuleert de transcriptie van het IgH-gen: in de B-lymfocyten is dit gen uiteraard zeer actief. Zo wordt ook de transcriptie van het BCL2-gen sterk gestimuleerd. Deze t(14;18) translocatie komt bij >90% van de folliculaire B-cel lymfomen voor. Hiervoor geldt situatie B, zie plaatje eronder.
Welke blot past bij deze patiënt (met folliculair B-cellymfoom)?
Blot C, omdat het niet twee genen zijn die bij elkaar komen. Het is 1 gen waarvan het expressieniveau is veranderd.
Wat kun je zeggen over AML met een normaal karyotype?
30% van de mensen met AML met een normaal karyotype hebben een insertie van 4 nucleotide in het NPM1 gen (altijd dezelfde mutatie, TCTG). De helft heeft ook nog een mutatie in FLT3, er vindt hier ook insertie plaats, maar altijd een insertie die een veelvoud van drie is. De patiënten met alleen een NPM1 mutatie doen het beter dan mensen met een mutatie in NPM1 en FLT3. De laatste patiënten krijgen chemotherapie en een allogene transplantatie. Mensen met alleen NPM1 krijgen alleen chemo.
