HC 3.7 Proteomics, metabolomics, miRNA's en RNAi screens Flashcards
Wat is proteomics en waarvoor zou je het kunnen gebruiken?
Het meten van de hoeveelheid eiwitten.
- De hoeveelheid eiwit is een betere maat voor genexpressie dan mRNA.
- Het bepalen van een expressieprofiel van een eiwit is een stuk ingewikkelder en minder snel, maar er zijn nieuwe en verbeterde technieken waardoor het wel mogelijk is.
- Mogelijkheden voor analyse: eiwit-identificatie (kunnen bepalen welk eiwit het is), -modificatie (we willen kijken naar een actief eiwit, maar voordat een eiwit actief is ondergaat het modificaties) en -interactie mapping (kijken met welke andere eiwitten het interacteert).
Hoe kun je eiwit identificatie doen met massa spectrometrie?
Je hebt een eiwit of eiwitmengsel. Dit ga je knippen met behulp van trypsine digestie. Van die kleine stukjes selecteren we de massa met behulp van massa spectrometrie. Dan gaan we die massa’s vergelijken met hoe we ze kennen uit het humane proteoom. En aan de hand van de matches kunnen we bepalen welk eiwit we hebben.
Waarom knippen we het eiwit in stukjes? En waarmee doen we dit?
We knippen de stukjes omdat het dan makkelijker is om de massa te bepalen. We doen dit met het darmenzym trypsine, die knipt de peptidebindingen van eiwitten op specifieke plaatsen: op Arginine (R) en Lysine (K). We noemen zo’n stukje eiwit een tryptisch fragment omdat het door trypsine geknipt wordt.
Hoe werkt de MALDI-TOF massa spectrometrie?
In de sample plaat wordt ervoor gezorgd dat elk peptide een positieve lading krijgt. De sample plaat staat op een positieve pool. Positief + positief stoot elkaar af. De peptide komt dan in de gasfase terecht en verderop is een negatief geladen plaat, de peptide begint zich dus te bewegen richting de negatief geladen plaat. Er zit een gat in de plaat waardoor een deel van de moleculen in de vacuümbuis terechtkomen. De snelheid waarmee het deeltje beweegt is afhankelijk van de massa. Hoe kleiner de massa, hoe sneller het deeltje.
Hoe kunnen we aan de hand van de massa spectrometrie bepalen welk eiwit het is?
We kunnen aan de hand van de exacte massa bepalen welke aminozuren er in dat fragmentje zitten.
We kennen het hele menselijke genoom en we weten ook welke eiwitten er in dat genoom zitten. We kunnen met de computer van alle eiwitten alle mogelijke tryptische fragmenten bepalen. We weten van al die fragmenten de molecuulmassa. We vergelijken de gevonden molecuulmassa’s met de al bekende molecuulmassa’s en zo kan het eiwit worden geïdentificeerd.
Kunnen we het eiwit ook kwantificeren (bepalen hoeveel van het eiwit erin zit)?
Ja dat kan als een piek in een massaspectrum hoger is dan zit er meer van in, is de piek wat lager dan zit er minder van in.
Hoe kun je bekijken welk eiwit interacteert met het gewilde eiwit?
Je voegt eerst een antilichaam toe die bindt aan het gewilde eiwit (immunoprecipitation). We maken dat antilichaam vast aan iets dat onoplosbaar is. Nu zit ook dat eiwit vast waarvan we willen weten of dat aan ons eiwit bindt. Als we de rest van de eiwitten weg wassen, houden we alleen nog het eiwit over dat aan ons eiwit zit gebonden. En met behulp van massaspectrometrie kunnen we identificeren wat voor eiwit dat is.
Waar kun je achter komen door alle interacties van een eiwit in een figuur te zetten?
Door alle interacties in een figuur te zetten, kunnen we meer te weten komen over de complexe regulatiecircuits in cellen. Dit kan dan weer gebruikt worden om genexpressie profielen te begrijpen.
Hoe kun je met massaspectrometrie kijken naar eiwitmodificatie?
Door een modificatie krijgt het stukje tryptisch fragment een zwaardere massa. Als we dan bijvoorbeeld een bepaalde proteïne kinase remmen, kunnen we erachter komen dat dit eiwit door die kinase gefosforyleerd werd als de massa afneemt. Je kan dus bijvoorbeeld ook kijken hoe groot deel van het eiwit actief is en welk deel inactief is.
Wat is metabolomics?
Metabolomics analyseert welke metabolieten voorkomen, bijvoorbeeld in het bloed.
Kan metabolomics een marker zijn voor de aanwezigheid van een tumor?
Ja, want een tumor veranderd zijn energievoorziening, dus je kan bijvoorbeeld een verandering van metabolieten in het bloed zien.
Hoe kan je metabolomics analyseren?
We starten met een sample. Vervolgens doen we een massaspectrometrie. Met de massa kunnen we bepalen welke metabolieten er aanwezig zijn en hoeveel er daarvan aanwezig zijn. Dit kunnen we analyseren met behulp van een computer. En dan kijken we of we een patroon kunnen herkennen. Het liefst willen we ook een biomarker vinden, zodat we het in een vroeg stadium kunnen herkennen voordat iemand er ziek van wordt.
Waarom is mRNA niet altijd voorspellend voor eiwit(activiteit)?
Regulatie van eiwitmodificaties (wordt het eiwit wel actief), eiwitstabiliteit (afbraak) en translatie (verloopt de translatie goed).
Hoe wordt de translatie gereguleerd?
Er zijn genen in het DNA die niet coderen voor een eiwit maar voor hele kleine stukjes RNA. Die de translatie van mRNA beïnvloeden. Deze korte stukjes RNA heten microRNAs. Het microRNA wordt door Drosha in de celkern en door Dicer in het cytoplasma op maat geknipt, van dit stukje dubbelstrengs DNA wordt een enkele streng ingebouwd in het miRISC complex. Dit complex kan binden aan meestal een 3’ uiteinde van een mRNA molecuul. Als dit dan bindt dan verminderd het de translatie van de mRNA.
Door de transcriptie van miRNA te reguleren kan de hoeveelheid eiwit die er gemaakt wordt en hoeveel er van specifieke witten gemaakt wordt worden beïnvloedt.
Waarom zou je niet gewoon minder mRNA maken in plaats van miRNA?
- miRNA kun je snel maken en weer afbreken. Je kunt hierdoor het mRNA dat er al was niet laten transleren.
- miRNA bindt aan een heleboel verschillende mRNAs waardoor je tegelijkertijd meerdere mRNAs kunt reguleren.
Wat is siRNA?
Short interferring RNA. Een stukje RNA dat wij de cel inbrengen. De cel gaat dat vervolgens inbrengen in het RISC complex. Dit gaat weer op mRNA zitten en dan wordt dat mRNA afgebroken of in ieder geval niet meer tot expressie gebracht.
RNA interferentie kan voorkomen dat eiwitten die essentieel zijn voor de groei van kankercellen tot expressie komen. Het wordt vooral nu voor onderzoek gebruikt, want het is te ingewikkeld om dit te geven als medicament.
Hoe kan siRNA in onderzoek worden gebruikt?
Op een plaat liggen allemaal belletjes en in die belletjes zitten cellen. In belletje 1 schakel je met siRNA eiwit 1 uit, etc. We kunnen dan kijken wat het effect daarvan is op de cellen. We kunnen dit gebruiken om te kijken welk eiwit essentieel is voor bepaalde kankercellen. Je wilt dan ook weten of dit eiwit essentieel is voor de normale cellen
