HC 3.3 Cytogenetische afwijkingen Flashcards
Wat is cytogenetica? En waarvoor kun je het gebruiken?
Cytogenetica houdt zich met name bezig met de lokalisatie van chromosomen, erfelijk eigenschappen in de celkern en overdracht van erfelijk materiaal. Het kan dus een belangrijke rol vervullen bij het stellen van een diagnose en prognose. Ook kunnen cytogenetische afwijkingen iets zeggen over het respons op chemotherapie. Daarnaast kan het wat vertellen over leukemogenese en hematopoëse, het helpt bij het identificeren van de betrokken genen. Daarnaast kan er op die manier medicatie op worden gebaseerd.
Wat kun je zeggen over de verschillende cytogenetische eigenschappen bij leukemie en de prognose die daarbij past? Welke geven een goede prognose en welke een slechte?
- Een t(8;21)(q22;q22) en een inv(16)/t(16;16) bij AML geven een goede prognose.
- Een complex karyotype bij MDS geeft een slechte prognose.
- 5q- bij MDS geeft een goede prognose (IPSS-R).
- 7q- bij MDS geeft een intermediaire prognose (IPSS-R).
Wat is het verschil tussen cytogenetica en normale genetica?
Het verschil tussen cytogenetica en normale genetica is de verdieping van genetica op DNA niveau, waarbij cytogenetica op chromosoomniveau kijkt.
Welke (cyto)genetische afwijkingen zien we bij AML?
Bij ongeveer 50% van de patiënten met AML zijn er geen afwijkingen zichtbaar in een chromosomen (ze hebben een normaal karyotype). Deze patiënten hebben echt bijv. wel moleculaire afwijkingen. Bij 11% van de patiënten met AML wordt een complex karyotype gezien, bij 23% wordt zowel chromosomale als genetische afwijkingen gezien.
Hoe kunnen we de chromosomale afwijkingen identificeren? Welke methoden gebruiken we daarvoor?
Klassieke cytogenetica (banderings technieken)
Moleculaire cytogenetica
- Fluorescente in situ hybridisatie (FISH)
- Array (SNP array)
Moleculaire diagnostiek
- RQ-PCR (fusie genen)
- Q-PCR
- Sequencing (Sanger => Next Generation Seq)
Hoe kunnen we de cellen kweken zodat we de chromosomen kunnen zien?
Normaal gesproken zijn chromosomen niet zichtbaar in de cel wanneer er geen celdeling plaatsvindt. Je gaat materiaal kweken: beenmerg of bloed. Het liefst beenmerg omdat daar voorlopercellen in zitten. Aan dat kweekmedium worden groeifactoren toegevoegd om de leukemische cellen te triggeren om zich te delen. Dit kweken duurt 1-2 dagen, waarna met colcemid de celdeling wordt stopgezet (mitose blok). De chromosomen zijn tijdens de metafase dus bevroren. Er wordt dan een hypotone oplossing toegevoegd, waardoor de cellen zwellen en vervolgens kapot gaan. De kapotte cellen (met celkern en celdeling) worden gefixeerd met methanol-azijnzuur, waardoor de membraan ontvet wordt. Bij het druppelen van de suspensie op het glaasje, zullen de membranen breken. De laatste fase bestaat uit de bandering, met keuze uit R-, G- of Q-bandering.
Welke soorten bandering zijn er? En wat kun je zeggen over bandering?
R-, G- of Q-bandering. Na bandering is er een streepjescode op het chromosoom te zien. Elk chromosoom heeft zijn eigen unieke streepjescode. De ligging van het centromeer is voor elk chromosoom uniek.
Hoe ziet een chromosoom eruit? Hoe kun je beschrijven waar de afwijking zich bevindt op het chromosoom?
Een chromosoom bestaat normaal gesproken uit een centromeer, met daarboven een korte arm (P-arm) en daardoor een lange arm (Q-arm). Om een bepaalde locatie van mutatie aan te geven wordt het volgende gezegd: de mutatie zit in chromosoom één, in de Q-arm op positie 2.5 (regio 2, band 5).
Welke chromosomen hebben in principe geen korte arm en hoe komt dat?
Chromosoom 13, 14, 15, 20 en 21 hebben in principe geen korte arm, maar hebben op deze plek een repetitieve DNA-sequentie voor het ribosomale DNA zitten. Als hier een translocatie plaatsvindt, gaat het ribosomale DNA verloren. Dit heeft vaak geen consequenties, omdat deze sequentie op meerdere plekken aanwezig is.
Welke soorten chromosomale afwijkingen zijn er?
Numerieke afwijkingen en structurele afwijkingen. Onder structurele afwijkingen valt: gebalanceerd (geen verlies van materiaal) en ongebalanceerd (chromosomaal materiaal is verloren gegaan of erbij gekomen).
Wat zijn numerieke afwijkingen?
- Winst (van een compleet chromosoom)
- Verlies (van een compleet chromosoom)
Wat zijn gebalanceerde structurele afwijkingen?
- Translocatie (uitwisseling van terminaal chromosomaal segment): t(9;11) komt vaak voor bij AML ((p22;q23)).
- Inversie (binnen een chromosoom): Paracentrische inversie: binnen een chromosoom arm, zien we vaak in een inversie 3. Pericentrisch: rond een centromeer, zien we vaak in een inversie 16.
- Insertie
Wat zijn ongebalanceerde structurele afwijkingen?
- Deletie (deel van een chromosoom is verloren): Terminale deletie: einde van het chromosoom. Interstitiële deletie: binnen het chromosoom.
- Amplificatie (duplicatie, dmin, hsr)
- Niet-gebalanceerde translocatie
- Genmutatie (op niveau van baseparen, dus niet microscopisch zichtbaar)
Hoe beschrijf je een karyogram?
Het beschrijven van een karyogram gebeurt als volgt: eest het chromosomenaantal, dan het geslacht en als laatste de bijzonderheden (bijv. 45, XY, -7 [10]). Hier is uit op te maken dat het chromosoom 7 in 10 metafasen mist bij een mannelijk karyotype.
Hoe kun je translocaties herkennen op een karyogram?
Translocaties kunnen worden herkend doordat een stukje (een arm) van een chromosoom feller of juist minder fel aankleurt dan het chromosoom zelf. Sommige afwijkingen zijn echter cryptisch (moeilijker zichtbaar). Dat kan omdat er nauwelijks of geen verschil te zien is door de microscoop, ten gevolge van uitwisseling van te kleine stukken of uitwisseling van chromosomen die hetzelfde aankleuren.
Wat is FISH?
FISH is een methode om mutaties zichtbaar te maken. Deze techniek is erg beperkt, doordat het onderzoek is gericht op een specifiek target. Het is een techniek waarbij het DNA van een chromosoom (terwijl het in de kern zit) wordt gesmolten (de twee strengen zijn uit elkaar) door te verwarmen. Dan wordt een stukje enkelstrengs DNA (probe) eroverheen gewassen, wat hecht aan het uiteen gesmolten DNA van de patiënt. Een probe wordt dus gebruikt om aan te tonen of dat stukje DNA wel aanwezig is in de patiënt. Een fluorescerend label wordt aan de probe geplakt, zodat deze op de goede plek terug te vinden is.
Wat zijn Fusie-probes?
Fusie-probes zijn specifiek ontworpen om translocaties aan te tonen. Wanneer er geen sprake is van een translocatie, wordt er twee keer rood en twee keer groen gezien. Bij een translocatie verwisselen bijvoorbeeld de helften van chromosoom 18 en 14. Zo komt er dus een rood en groen signaal naast elkaar te liggen. Dit is een fusie-signaal en ziet er geel uit.
Wat zijn break-apart probes?
Bij break-apart probes gaan de stukken uit elkaar als er een breuk tussen komt. Als er geen translocatie is geweest, dan zijn er twee fusies zichtbaar (2x geel). In het geval dat er wel een translocatie heeft plaatsgevonden, wordt er slechts 1 fusie en verder nog een rood en groen signaal waargenomen. Je kan op deze manier ook ongebalanceerde translocatie waarnemen, dan zie je bijvoorbeeld een fusie en een losse groene of een fusie en een losse rode.
Hoe werkt de zuivering van plasmacellen?
Als eerst worden rode bloedcellen verwijderd uit het beenmerg de rode bloedcel lysis. Op de buitenkant van de plasmacellen zit een marker, CD-138. Door het juiste antilichaam er tegen aan te maken: anti-CD138, kunnen de cellen worden geselecteerd. Antilichamen worden aan beads (magneten) gekoppeld, waardoor CD-138 aan het antilichaam bindt. Als er vervolgens een magneet bij wordt gehouden, dan blijven de beads samen met de plasmacellen hangen aan de magneet. De plasmacellen blijven alleen over.
Hoe werkt de SNP-array?
Als het ene allel A wordt genoemd en het andere B, dan betekend dit dat ieder individu AA, AB of BB heeft. Het voordeel is dat deleties of duplicaties heel makkelijk kunnen worden opgespoord. Door die allelen verschillende kleurtjes te geven, kan er worden gekeken naar verhoudingen.
Hoe wordt de analyse van de SNP-array gedaan?
De analyse wordt gedaan m.b.v. de LogR en de B-allele frequency. De LogR is een maat voor het aantal kopieën dat aanwezig is. Een LogR van 0 betekend een copy aantal van 2. De B-allele frequency zegt iets over de frequentie van de SNP. Wanneer er 1 allel zichtbaar is, is dit een teken van deletie (2 strepen zichtbaar), waar 3 zichtbare allelen een teken is van duplicatie (4 strepen zichtbaar). Wanneer 2 allelen zichtbaar zijn, maar alleen de allelen AA en BB, is dit een teken van verlies van heterozygositeit (2 strepen zichtbaar).
Waarom zie je bij de 2x 9 gain wel een 4 banden patroon en bij de 2x 19 gain niet?
Omdat bij de 2x 19 de verhouding 2 op 2 is en bij de 2x 9 de verhouding 1 op 3 is.
Welke afwijkingen zijn wel of niet zichtbaar met FISH of SNP array?
