HC 5.2 Pathologische technieken bij diagnose van kanker

Question 1

Wat gebeurt er vanaf het moment dat het biopt zich in het potje bevindt?

Answer 1

In het potje vindt er al fixatie plaats, in het potje zit namelijk formaline (enorm reactief). Het doel is om het biopt in de cassettes te krijgen (bakjes). Uitpakken op het pathologie laboratorium, de excisie of biopt moet verwerkt worden, dat wil zeggen: fixeren, solvent verandering, inbedden … ten behoeve van de microscopie.

Question 2

Waarom gebruiken we een formaline oplossing?

Answer 2

• Weefsel degradeert door enzymen (autolyse) en door inwerking microben. Formaline stopt dit. Dit gebeurt door het crosslinken van de eiwitten.
• Weefsel zonder fixatie is te zacht om heel dun te snijden. Formaline crosslinkt eiwitten zodat weefsel hard wordt (gefixeerd).

Question 3

Wat gebeurt er na de fixatie?

Answer 3

Kleine preparaten zijn bij aankomst al grotendeels gefixeerd. Grote preparaten na operatie eerst fixeren. Daarnaast moet de solvent ook worden verwisseld, van hydrofiel naar hydrofoob (“doorvoeren”). Meestal enige uren –> inbedden. Want de volgende stap is inbedden in paraffine. Je legt het biopt in de parafine en zet de cassette er bovenop. Dan moet de paraffine opdrogen en dan bevat de cassette nu, met formaline gefixeerd paraffine ingebed weefsel –> FFPE (Formaline Fixed-Paraffine Embedded).

Question 4

Hoe snijdt je het FFPE?

Answer 4

Je snijdt het weefsel op een microtoom, in dunne plakjes paraffine met stukje van het biopt (5-7 micrometer dik).

Question 5

Wat gebeurt er met de gesneden plakjes paraffine?

Answer 5

De paraffine plakjes-met-stukjes-biopt op een glaasje plakken –> vastbakken op warmte plaat –> kleurmachine: hematoxyline-eosine kleuring (HE). Nu heb je transparante coupes. Nu kunnen we het pas onderzoeken, dit duurt zo’n 24 uur.
Alle geprocesste blokjes kun je bewaren in een archief –> restmateriaal biobank

Question 6

Welke technieken heb je om een biopt te verkrijgen?

Answer 6

• Aspiratie / Smears
• Vriescoupe
• Biopt
• Incisie (een snede in deel van het lichaam) / Excisie (een huidafwijking wordt weggesneden)
• Resectie

Question 7

Wat zijn aspiratie / smears?

Answer 7

Een cytologische techniek, hierbij is formaline, inbedden, snijden allemaal niet nodig. Het is wel minder nauwkeurig. Het is als kijken naar een mozaïek bestaande uit losse stukjes.

Question 8

Wat is een vriescoupe?

Answer 8

Dit is als de arts bijvoorbeeld tijdens een operatie nog een metastase ziet die hij wil laten onderzoeken, dan kan het biopt worden bevroren, dan wordt het ook hard en vindt er geen autolyse plaats. En dan kan het biopt in plakjes gesneden worden. Maar dit is weer minder nauwkeurig.

Question 9

Wat is een resectie?

Answer 9

Iets in zijn geheel weg halen met een gezonde marge eromheen. Operatieve verwijdering door snijdend specialist. Vaak grotere preparaten die bewerking vereisen.

Question 10

Wat zijn manieren om moeilijk bereikbare plekken te biopteren?

Answer 10

• Op geleide palpatie
• Op geleide ultrasound
• Op geleide CT
• Op geleide MRI
• Soms ‘blind’ (bv verhoogd serum PSA maar geen evidente palpabele of echografische afwijkingen)
• In het algemeen altijd multiple biopten, bilateraal tot 12

Question 11

Waarom zou je het ene biopt invriezen en het andere biopt in paraffine doen?

Answer 11

Bevriezen is een nood procedure, het is ook een zeer tijdrovende procedure. We doen daarom normaal gesproken formaline en paraffine inbedden: want hiermee kunnen we grote aantallen bewerken. Daarnaast is invriezen minder nauwkeurig en het archiveren gaat moeilijk, want je moet het bevroren houden.

Question 12

Wat is het verschil tussen een bot en huidbiopt?

Answer 12

Een botbiopt is dus iets bewerkelijker dan een huidbiopt of maagbiopt. Het bevat namelijk hydroxy-apatiet (gemineraliseerd) en is te hard om met formaline te fixeren. Men moet het eerst ontkalken.

Question 13

Waarin wordt de naalddikte uitgedrukt?

Answer 13

De naalddikte wordt uitgedrukt in Gauge (G). Als de naalddikte te klein is heb je geen samenhang meer in het weefsel en houd je alleen losse cellen over. Deze grens ligt ongeveer bij naalden van 21-22 G. Hoe lager de G hoe dikker de naald.

Question 14

Wat zijn de kenmerken van vriescoupes?

Answer 14

Omzeilen de hele pathologie workflow met fixeren en inbedden. Gebeurt meestal peroperatief om direct een snijdende specialist te kunnen informeren over de aard van iets wat aangetroffen wordt of over de eventuele radicaliteit van de ingreep. De dokteren willen zeker weten of ze de hele tumor hebben verwijderd of ze weer in het sano zitten (het gezonde weefsel). Het duurt 35 minuten voordat de uitslag er is.

Question 15

Wat zijn belangrijke kenmerken om de diagnose kanker te kunnen stellen?

Answer 15

1. Voor de definitieve diagnose kanker is morfologie belangrijk.
2. “diagnostische” biopten of excisies uit een gezwel vinden plaats om de diagnose vast te stellen en een behandelplan te maken.
3. NB. ook andere laboratorium technieken kunnen bijdragen aan kanker diagnoses. Bv PSA, CEA of AFP in bloed (zogenaamde tumormarkers).
   a. Groot nadeel van de markers is dat ze heel aspecifiek zijn. PSA kan al verhoogd zijn bij een ontstoken prostaat, CEA dan weet je niet waar het vandaan komt, en bij AFP is bij groot aantal tumoren die het moeten produceren weer negatief.
4. Na diagnose kanker op basis van een biopt kan een grotere ingreep (chirurgische behandeling) volgen.

Question 16

Hoe nemen we van een chirurgische resectie biopten en hoe noemen we dat?

Answer 16

Bij chirurgische resecties is de diagnose vaak al bekend. De ingreep of resectie is de tweede stap. Het laboratorium kan niet ‘alles’ insluiten in cassettes  te veel. Er moet worden bemonsterd. Voor hemicolectomie meestal 10-15 cassettes. Niet overal in de resectie bevindt de tumor, dus er moet gericht worden bemonsterd. Er wordt dan vanuit het orgaan dat is verwijderd nog een biopt genomen (bemonsteren).
Dus na het ontvangst van het orgaan wordt het gefixeerd, dan lamelleren (in plakjes snijden), dan wordt het bekeken en dan wordt er een monster van gemaakt.

Question 17

Wat kan de radioloog doen om de chirurg te helpen met een moeilijk vindbare tumor in een orgaan?

Answer 17

Soms is de tumor moeilijk te vinden in het orgaan. Dan heeft de radioloog hem bijvoorbeeld gezien en kan de chirurg hem vervolgens niet meer vinden. Daarom vindt er soms draadlocalisatie plaats. Dan wordt er een draad doorheen gestoken en dan weet de chirurg precies waar die moet zijn.

Question 18

Wat wordt er met grote chirurgische preparaten in het lab gedaan?

Answer 18

Die grote chirurgische preparaten komen op het laboratorium als de diagnose al vast staat. Het wordt dan gebruikt om de therapie te controleren. Heeft de chirurg de tumor in zijn geheel verwijderd. Dit draagt ook bij aan de TNM classificatie. We kunnen ook de lymfeklieren samplen om te kijken of die ook vrij zijn van tumor.

Question 19

Wanneer is cytologie alleen al genoeg?

Answer 19

Als je al later in het traject staat is controle met behulp van cytologie soms al genoeg, maar aan het begin van het traject is histologie echt nodig.

Question 20

Wat is in het begin van het traject belangrijk voor de diagnose kanker?

Answer 20

Histologie. Ook de klinische info en imaging, bloed en vloeistoffen testen is nodig voor het vaststellen van de diagnose.

Question 21

Wat zijn de kenmerken van cytologie?

Answer 21

Voor cytologie is geen fixatie en inbedden nodig. Het gaat dus veel sneller. Het kan meteen op het glas worden geplaatst, er moet wel nog een stain overheen anders kunnen we de cellen van elkaar niet onderscheiden.
Cytologie = goedkoop, snel, maar minder nauwkeurig. De manieren om aan cytologie preparaten te komen zijn met behulp van:
- Op geleide palpatie
- Op geleide ultrasound
- Er is geen verdoving nodig.
- Duur: in het algemeen enkele tientallen seconden.

Question 22

Hoe kunnen we preparaten verkrijgen voor de cytologie, welke twee manieren zijn er?

Answer 22

Over het algemeen doen we het prikken maar je kunt ook met een spateltje/borstel ergens wat vanaf schrapen dit noem je exfoliatieve cytologie. De afgestreken cellen worden dan op vloeistof gebracht. Hiervan wordt een preparaat gemaakt en dit kun je kleuren met een speciale mix: de papanicolaou stain.

Question 23

Wat zijn de hulptechnieken voor de histologie en cytologie?

Answer 23

immunohistochemie, moleculaire technieken, image and pattern recognition.

Question 24

Wat is immunohistochemie?

Answer 24

Immunohistochemie speelt een rol bij de precieze typering van kankers. Er worden kleuringen gebruikt om de aanwezigheid van bepaalde eiwitten aan te tonen. Immunohistochemie is vooral gericht op het aantonen van eiwitten. Je laat een antistof binden aan het eiwit, dit duurt zo’n 20 minuten. Dan spoel je derest van de antistoffen weg. Dan voeg je een secundaire antistof toe die het primaire antistof herkent. En het secundaire antistof bevat een tag, een enzym vaak. Dan bied je een substraat aan, en dat slaat alleen daar neer waar het secundaire antistof zich bevindt en daardoor is het zichtbaar.

Question 25

Welke verschillende moleculaire technieken kennen we?

Answer 25

1. Polymerase ketting reactie op formaline gefixeerd, paraffine embedded weefsel. Wel eerst DNA isoleren. Dan (multiplex) PCR of quantitatieve PCR. Bv BRAF mutatie aantonen of uitsluiten.
2. In situ hybridisatie met probes op bv ALK, EBER, etc. : fluorescent tagging van DNA en RNA.
3. Multimodaliteit in situ techniek: array.

Question 26

Wat kun je zeggen over NGS en tumoren?

Answer 26

Bepaald vele tumorgenen tegelijk (50/60 regio’s tot 1000). Op tumor weefsel is er veel heterogeniteit. NGS opent de deur voor exome sequencing (WES) van alle tumoren of alle genen/DNA sequenties (WGS).
Tumoren hebben soms 100-1000-en mutaties en met onbekende betekenis –> bioinformatica is nodig voor data ordening en interpretatie. We maken onderscheid tussen driver mutaties en passenger mutaties.

Question 27

Waarop doen we meestal NGS bij de pathologie en waarom is dat zo?

Answer 27

NGS kan op paraffine, maar het gebeurt meestal op vers serum of bloedmateriaal. Want dat is gemakkelijker. Je moet als je gebruikt maakt van paraffine alle stukjes DNA aan elkaar plakken en formaline maakt ook al een deel van het DNA kapot dus dan moet je ook weer corrigeren voor die artefacten.