HC 2.6 Next Generation Sequencing (NGS) Flashcards
Hoe zijn de basen met elkaar verbonden?
De basen A-T zijn verbonden met twee waterstofbruggen, C-G zijn verbonden met drie waterstofbruggen. Dit zorgt ervoor dat ze alleen aan elkaar kunnen binden en daarnaast is de C-G binding hierdoor sterker. Het DNA wordt opgebouwd uit een suikerfosfaat backbone.
Wat is de historie van de PCR?
Structuur van DNA werd opgehelderd door Watson & Crick in 1953, hiervoor ontvingen ze de Nobelprijs in 1962, ze toonden aan dat DNA een dubbele helix was. In 1977 werd er een vorm van sequencing uitgevonden door Sanger hiervoor ontving hij in 1980 de nobelprijs.
Voor PCR worden bacteriën (thermus aquaticus) uit geisers gebruikt, omdat deze levensvatbaar zijn tot 120 graden celcius, dit het je nodig voor PCR. Omdat de bacteriën ook DNA-polymerase bevatten, humaan DNA-polymerase trekt die hoge temperaturen niet. Deze doorbraak kwam in 1983, en hier krijg Mullis in 1993 de Nobelprijs voor.
Wat is het doel van NGS?
Bij Next Generation Sequencing wordt de volgorde van de nucleotiden bepaald. Door het bepalen van de volgorde weten we voor welke aminozuren het codeert en hoe het eiwit er uiteindelijk uit komt te zien.
Hoe werkt PCR?
- Een dubbelstrengs DNA-molecuul gaat uit elkaar door temperatuurverhoging (> 90 graden celcius)
- De temperatuur gaat omlaag en primers (als starters) die complementair zijn aan een stukje van het template DNA worden toegevoegd.
- Basen worden toegevoegd.
- DNA-polymerase wordt toegevoegd.
- Nieuwe DNA-strengen worden gemaakt
Deze cyclus wordt bijvoorbeeld 30 keer herhaald waardoor meer dan een miljard DNA-moleculen ontstaan. Daarna kun je de volgorde van het stukje DNA gaan bepalen.
Uit hoeveel basen bestaat het humane genoom? Hoeveel genen zijn dat? Hoelang heeft dit geduurd en hoeveel heeft dit gekost? Hoelang zouden we er nu over doen?
Het volledige humane genoom wordt met 3 x 109 (3 miljard) basen beschreven. Dit zijn ongeveer 22.000 genen. Om dit te bepalen heeft het 10 jaar geduurd en 100 miljoen euro gekost –> stel je zou het nu willen bepalen duurt het een paar dagen en kost het 1000 euro.
Welke puntmutaties kennen we?
- Puntmutatie waardoor het aminozuur niet veranderd = silent mutatie
- Puntmutatie waardoor het aminozuur veranderd = missense mutatie
- Puntmutatie waardoor het codon een stopcodon wordt = nonsense mutatie
Wanneer kunnen we DNA sequencing toepassen voor oncologie?
- Differentiaal diagnostiek (diagnose A of B)
- Therapiekeuze (therapie A of B)
- Clonaliteitsanalyse (metastase of 2e primaire tumor): we kijken dan naar de mutaties van beide tumoren en dan kunnen we zien of het dezelfde tumor is of een nieuwe tumor.
- Oncogenetica (erfelijke tumorsyndromen) in samenwerking met klinische genetica
- Weefselidentificatie (weefsel van patiënt A of patiënt B)
Wat gebeurt er bij NGS?
Elk DNA molecuul wordt hierbij apart bekeken (single molecule) en allemaal tegelijk (massively parallel).
Welke twee vormen van NGS zijn er?
- Amplication enrichment
- Hybridization enrichment
Wat houdt amplication enrichment in?
Amplication enrichment: er wordt een specifiek deel van het genoom gesequenced. Je gebruikt primers en je zorgt dat deze net voor en na de Target region binden. Dan start je de PCR reactie, hierdoor wordt dat specifieke stuk heel vaak gekopieerd. Daarna worden er adapters aangebracht voor de sequencing.
Wat houdt hybridization enrichment in?
Hybridization enrichment: je hebt een DNA molecuul met verschillende regio’s van interesse. Dit DNA molecuul wordt gefragmenteerd (je kijkt altijd naar een mix van meerdere cellen, daardoor is de kans groter dat het gebied van interesse op de juiste manier wordt gefragmenteerd). Vervolgens worden er adapters aangebracht voor latere sequencing. Daarna binden er probes aan de stukjes DNA waarin je geïnteresseerd bent, de probes zijn gelabeld met biotine. De probes binden aan beads, de beads kun je vervolgens weer uitfilteren door middel van magnetisme of gewicht. Uiteindelijk heb je de stukjes van interesse over.
Wat gebeurt er met de stukjes DNA na de amplificatie?
De adaptoren die je hebt toegevoegd binden aan een flow-cel. De stukjes DNA maken een bocht naar de primer die aan de flowcel zit gebonden. En vervolgens begint de PCR reactie weer. Vervolgens verhoog je weer de temperatuur en dan splitsen de strengen weer, dit herhaal je weer 30 keer. Hierdoor ontstaan er clusters van dezelfde DNA-moleculen. De sequencing vindt plaats tijdens de synthese. Elke nucleotide heeft zijn eigen fluorisering (kleur), en nadat er een nucleotide wordt ingebouwd wordt er een foto gemaakt.
- T = blauw
- A = oranje
- G = groen
- C = rood
Waarom is het aflezen van een flowcel moeilijk?
Op één flowcel zitten allerlei verschillende regio’s van het DNA molecuul, maar ook nog eens van verschillende patiënten. Door te kijken naar barcodes kunnen we onderscheid maken tussen de verschillende patiënten. Dit doen we door er een bepaalde nucleotide volgorde aan te hangen.
Wat betekend coverage?
Coverage: het aantal malen dat een base-positie is bepaald. Hoe hoger de coverage des te dieper gesequenced is (nauwkeuriger). Bij het hele genoom wordt er gesproken over Whole genome sequencing (WGS), deze is < 100 maal diep. Bij targeted sequencing (TS) worden honderd tot duizenden fragmenten gesequenced, waarbij een coverage wordt gebruikt van minimaal 500x. Door een hoge coverage te hebben kun je zelfs bij een laag tumorcel percentage de mutatie ontdekken.
Wat betekend variant allel frequency?
VAF (variant allel frequency) is het aantal malen dat een DNA-variant op een specifieke positie wordt gevonden ten opzicht van het referentie DNA. Dit is afhankelijk van het gen en het percentage tumorcellen. VAF = variant allel coverage / totale coverage * 100%.
Hoe bereken je vanuit het tumorcelpercentage het VAF?
Als het tumorcelpercentage 25% is, dan heeft 1 op de 4 cellen een afwijkend allel. Omdat het maar allel is die is aangedaan is de VAF 1 staat op 8 dus 12,5%.
Wat is het verschil tussen Sanger sequencing en NGS?
