Chimie ana : CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE : CLHP Flashcards
25/20/24 => Marylène Chollet-Krugler
Quelle est la méthode “classique” de la chromatographie liquide ?
- CL pratiquée dans des colonnes en verre (L = 20 - 80; dc = 1-5 cm)
- migration de la PM à pression atmosphérique
- support : gros grains (dp >100 mm)
=> Inconvénient = séparation lente et peu efficace
Caractéristiques de la chromatographie liquide à haute performance ?
UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography):
* granulométrie du support dp < 2µm
* colonne + courte (5 cm), pression 600
Quelles sont les principales méthodes en CLHP ?
- chrom. de partage ou liquide-liquide sur phase normale ou sur phase inverse
- chrom. d’adsorption ou liquide-solide
- chrom. par échange d’ions
- chrom. d’exclusion (perméation de gel et filtration de gel)
Caractéristiques du réservoir des solvants de l’appareil utilisé pour la CLHP ?
Un ou plusieurs réservoirs selon la nature de la PM équipée d’une chambre de mélange
Caractéristiques que doivent avoir les solvants utilisés pour la CLHP ?
Ils doivent ê :
* miscibles entre eux
* dégazés (par ultrasons ou barbotage d’un gaz inerte (He))
* filtrés
* de très bonne qualitée
Caractéristiques des pompes de l’appareil utilisé pour la CLHP ?
Remplissage colonne très compact : responsable de la perte de charge (DP) entre l’entrée et la sortie de la colonne (50-300 bar)
But de l’utilisation des pompes pour l’appareil utilisé pour la CLHP ?
- délivre la PM dans les dans des proportions définies et à un débit fixé
- forcer le passage de la phase mobile à travers la colonne → augmentation de la pression
=> Loi de Darcy
Composition de la PM dans la CLHP ?
- constante sur la durée de l’analyse : mode isocratique
- varie au cours du temps : mode gradient d’élution
En cas de CLHP en mode gradient, quelles sont les pompes que l’on peut utiliser ?
- Une pompe précédée d’une chambre de mélange basse pression : pompe quaternaire
- Deux pompes qui aspirent chacune un solvant puis une chambre de mélange, mélange obtenu sous haute pression : pompe binaire
Rôle des injecteurs des appareils utilisés pour la CLHP ?
- injection d’un volume précis de l’échantillon dans la colonne en un temps court
- injecteur manuel ou automatique
Caractéristiques des colonnes utilisées pour la CLHP ?
- petit tube métallique, toujours en acier inoxydable
- L : 3 - 30 cm; dc : 1 - 4,6 mm;
- PS maintenue entre 2 disques poreux.
- colonne souvent précédée d’une précolonne ou colonne de garde
- thermostatée
But de l’utilisation de détecteurs dans la CLHP ?
Mettre en évidence les solutés au fur et à mesure qu’ils sortent de la colonne
Quel est le “détecteur idéal” en CLHP ?
- Sensible
- Stable dans le temps
- Peu de bruit de fond
- Possède une réponse linéaire et rapide
- Domaine de linéarité élevé
- Exploitable en mode gradient
=> N’existe pas
Quels sont les principaux détecteurs utilisable en CLHP ?
spectrophotométrique UV/visible
spectrofluorimétrique
réfractométrique differentie
Détecteur évaporatf à diffusion de lumière
Détecteur à spectrométrie de masse
Principe du détecteur spectrophotométrique UV/visible ?
- Sélectif
- Mesure de l’absorbance à une ou plusieurs longueur d’onde (détecteur UV à barrette de diodes appelé DAD ou PDA)
- Mesure basée sur la loi de Beer-Lambert : A = elC
- Utilisable en mode gradient d’élution
Principe du détecteur spectrofluorimétrique ?
- sélectif : utilisable pour les composés naturellement fluorescents et pour tous ceux qui peuvent le devenir après un procédé de dérivation
- très sensible
- Intensité de fluorescence proportionnelle à la C°
- utilisable en mode gradient d’élution
Principe du détecteur réfractométrique differentiel ?
- universel
- mesure en continu la différence d’indice de réfraction entre la PM et la PM + échantillon
*peu sensible aux variations de C° - très sensible aux variations de T°
- ne peut pas être utilisé en mode gradient
Principe du détecteur évaporatif à diffusion de lumière ?
- assez universel (composés volatils non détectés)
- déviation de la lumière par un brouillard de particules solides ou liquides
- intensité proportionnelle à la C°
- utilisable en mode gradient d’élution
- DESTRUCTEUR
Principe de la chromatographie de partage en CLHP ?
- La + utilisée de tt les méthodes de CPL
- Fondée sur le partage KD du soluté entre 2 phases liquides : une phase aqueuse et une phase organique non miscible
*chromatographie liquide-phase greffée : PS mime un liquide : film liquide imprégné sur un support inerte fixé par liaison covalente
Principe du détecteur à spectrométrie de masse ?
- Détecteur le plus courant
- très sensible et quasi-universel
- intensité proportionnelle à la C°
- information supplémentaire : masse moléculaire des composés
- DESTRUCTEUR
Support de la chromatographie de partage en CLHP ?
=> Support à phase greffée
* Support : particule = solide inerte, Ø :1,5-15 mm
* phase greffée fixée sur le support sous forme de chaîne aliphatique de polarité et de longueur variable selon la nature de R
Utilisation des PS chirale en chromatographie de partage en CLHP ?
Pour séparer les 2 énantiomères d’un mélange racémique :
silice greffés avec par des cyclodextrines
Que permettent les différentes phases greffées de la chromatographie de partage en CLHP ?
à l’origine de 2 types de chromatographie de partage selon la polarité de la PS :
- phase normale
- à polarité de phase inversée
Caractéristiques de la chromatographie de partage en phase normale ?
- PS : polaire : groupements R = OH, CN, NH2
- PM : apolaire (hexane, heptane, cyclohexane … + modificateur) ou polaire (Mode HILIC)
=> Analyse de molécules polaires
Résultats de la chromatographie de partage en phase normale ?
- constituant le - polaire élué en premier
- réduction du tR si polarité PM augmente
- Solvant fort = solvant polaire
Caractéristiques de la chromatographie de partage à polarité de phase inversée ?
- PS : greffon apolaire : R = chaîne carbonée ( C8,C18)
- PM : polaire : mélange méthanol / eau ou acétonitrile / eau
=> Analyse de molécules apolaires
*constituant le moins polaire
élué en dernier
augmentation du tRsi polarité
PM augmente
ordre d’élution inversé par
rapport à une phase normale
Solvant fort: méthanol ou ACN *
Règle générale de la CLHP ?
séparations chromatographiques effectuées avec PS de polarité proche de celle de l’échantillon et PM de polarité extrêmement différente
Caractéristiques de la chromatographie d’adsorption ?
- PS : adsorbant polaire(gel de silice SiO2ou d’alumine Al2O3finement divisée)
- PM : liquide (solvant organique)
=> Chromatographie liquide-solide
Les composés sont +/-retenus à la surface du gel par formation de liaison spécifiques de surface (interactions dipolaires) entre l’adsorbant et la molécule adsorbée
Quels sont les “temps” de la chromatographie d’adsorption ?
- fixation réversible (liaisons de faibles énergies) sur un support solide = adsorption
- désorption : remise en solution du soluté par rupture des liaisons précédentes grâce à son entrainement par la PM
Facteurs impactant l’intensité de l’adsorption ?
Structure chimique acides > bases > alcools > aldehyde > cetones > esters > halogénés > carbures
insaturés > carbures saturés
Masse molaire (MM) plus MM élevée plus adsorption forte
pH de la PM
