Chimie ana : CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE : CLHP

Question 1

Quelle est la méthode “classique” de la chromatographie liquide ?

Answer 1

• CL pratiquée dans des colonnes en verre (L = 20 - 80; dc = 1-5 cm)
• migration de la PM à pression atmosphérique
• support : gros grains (dp >100 mm)
  => Inconvénient = séparation lente et peu efficace

Question 2

Caractéristiques de la chromatographie liquide à haute performance ?

Answer 2

UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography):
* granulométrie du support dp < 2µm
* colonne + courte (5 cm), pression 600

Question 3

Quelles sont les principales méthodes en CLHP ?

Answer 3

• chrom. de partage ou liquide-liquide sur phase normale ou sur phase inverse
• chrom. d’adsorption ou liquide-solide
• chrom. par échange d’ions
• chrom. d’exclusion (perméation de gel et filtration de gel)

Question 4

Caractéristiques du réservoir des solvants de l’appareil utilisé pour la CLHP ?

Answer 4

Un ou plusieurs réservoirs selon la nature de la PM équipée d’une chambre de mélange

Question 5

Caractéristiques que doivent avoir les solvants utilisés pour la CLHP ?

Answer 5

Ils doivent ê :
* miscibles entre eux
* dégazés (par ultrasons ou barbotage d’un gaz inerte (He))
* filtrés
* de très bonne qualitée

Question 6

Caractéristiques des pompes de l’appareil utilisé pour la CLHP ?

Answer 6

Remplissage colonne très compact : responsable de la perte de charge (DP) entre l’entrée et la sortie de la colonne (50-300 bar)

Question 7

But de l’utilisation des pompes pour l’appareil utilisé pour la CLHP ?

Answer 7

• délivre la PM dans les dans des proportions définies et à un débit fixé
• forcer le passage de la phase mobile à travers la colonne → augmentation de la pression
  => Loi de Darcy

Question 8

Composition de la PM dans la CLHP ?

Answer 8

• constante sur la durée de l’analyse : mode isocratique
• varie au cours du temps : mode gradient d’élution

Question 9

En cas de CLHP en mode gradient, quelles sont les pompes que l’on peut utiliser ?

Answer 9

• Une pompe précédée d’une chambre de mélange basse pression : pompe quaternaire
• Deux pompes qui aspirent chacune un solvant puis une chambre de mélange, mélange obtenu sous haute pression : pompe binaire

Question 10

Rôle des injecteurs des appareils utilisés pour la CLHP ?

Answer 10

• injection d’un volume précis de l’échantillon dans la colonne en un temps court
• injecteur manuel ou automatique

Question 11

Caractéristiques des colonnes utilisées pour la CLHP ?

Answer 11

• petit tube métallique, toujours en acier inoxydable
• L : 3 - 30 cm; dc : 1 - 4,6 mm;
• PS maintenue entre 2 disques poreux.
• colonne souvent précédée d’une précolonne ou colonne de garde
• thermostatée

Question 12

But de l’utilisation de détecteurs dans la CLHP ?

Answer 12

Mettre en évidence les solutés au fur et à mesure qu’ils sortent de la colonne

Question 13

Quel est le “détecteur idéal” en CLHP ?

Answer 13

• Sensible
• Stable dans le temps
• Peu de bruit de fond
• Possède une réponse linéaire et rapide
• Domaine de linéarité élevé
• Exploitable en mode gradient
  => N’existe pas

Question 14

Quels sont les principaux détecteurs utilisable en CLHP ?

Answer 14

 spectrophotométrique UV/visible
 spectrofluorimétrique
 réfractométrique differentie
 Détecteur évaporatf à diffusion de lumière
 Détecteur à spectrométrie de masse

Question 15

Principe du détecteur spectrophotométrique UV/visible ?

Answer 15

• Sélectif
• Mesure de l’absorbance à une ou plusieurs longueur d’onde (détecteur UV à barrette de diodes appelé DAD ou PDA)
• Mesure basée sur la loi de Beer-Lambert : A = elC
• Utilisable en mode gradient d’élution

Question 16

Principe du détecteur spectrofluorimétrique ?

Answer 16

• sélectif : utilisable pour les composés naturellement fluorescents et pour tous ceux qui peuvent le devenir après un procédé de dérivation
• très sensible
• Intensité de fluorescence proportionnelle à la C°
• utilisable en mode gradient d’élution

Question 17

Principe du détecteur réfractométrique differentiel ?

Answer 17

• universel
• mesure en continu la différence d’indice de réfraction entre la PM et la PM + échantillon
  *peu sensible aux variations de C°
• très sensible aux variations de T°
• ne peut pas être utilisé en mode gradient

Question 18

Principe du détecteur évaporatif à diffusion de lumière ?

Answer 18

• assez universel (composés volatils non détectés)
• déviation de la lumière par un brouillard de particules solides ou liquides
• intensité proportionnelle à la C°
• utilisable en mode gradient d’élution
• DESTRUCTEUR

Question 19

Principe de la chromatographie de partage en CLHP ?

Answer 19

• La + utilisée de tt les méthodes de CPL
• Fondée sur le partage KD du soluté entre 2 phases liquides : une phase aqueuse et une phase organique non miscible
  *chromatographie liquide-phase greffée : PS mime un liquide : film liquide imprégné sur un support inerte fixé par liaison covalente

Question 19

Principe du détecteur à spectrométrie de masse ?

Answer 19

• Détecteur le plus courant
• très sensible et quasi-universel
• intensité proportionnelle à la C°
• information supplémentaire : masse moléculaire des composés
• DESTRUCTEUR

Question 20

Support de la chromatographie de partage en CLHP ?

Answer 20

=> Support à phase greffée
* Support : particule = solide inerte, Ø :1,5-15 mm
* phase greffée fixée sur le support sous forme de chaîne aliphatique de polarité et de longueur variable selon la nature de R

Question 21

Utilisation des PS chirale en chromatographie de partage en CLHP ?

Answer 21

Pour séparer les 2 énantiomères d’un mélange racémique :
silice greffés avec par des cyclodextrines

Question 22

Que permettent les différentes phases greffées de la chromatographie de partage en CLHP ?

Answer 22

à l’origine de 2 types de chromatographie de partage selon la polarité de la PS :
- phase normale
- à polarité de phase inversée

Question 23

Caractéristiques de la chromatographie de partage en phase normale ?

Answer 23

• PS : polaire : groupements R = OH, CN, NH2
• PM : apolaire (hexane, heptane, cyclohexane … + modificateur) ou polaire (Mode HILIC)
  => Analyse de molécules polaires

Question 24

Résultats de la chromatographie de partage en phase normale ?

Answer 24

• constituant le - polaire élué en premier
• réduction du tR si polarité PM augmente
• Solvant fort = solvant polaire