3.7 Proteomics, Metabolomics, MicroRNA, SiRNA

Question 1

Wat is proteomics?

Answer 1

Onderzoekt alle eiwitten van de cel.
Hoeveelheid eiwit is betere maat voor genexpressie dan mRNA, omdat mRNA zorgt voor meer dan alleen eiwit synthese

Het verloopt nog niet zo snel en gemakkelijk, maar nieuwe en verbeterde technieken maken dit wel mogelijk.

Mogelijkheden voor analyse: Eiwit-identificatie, -modificatie en -interactie mapping

Question 2

Hoe werkt massa spectrometrie?

Answer 2

Manier om eiwitten te identificeren

Eiwit of eiwitmengsel -> Trypsine digestie -> Analyse met massa spectrometrie -> Data vergelijking (Humane Genoom Project) -> Identificatie van het eiwit

Question 3

Wat doet trypsine?

Answer 3

Darmenzym trypsine knipt peptidebindingen van eiwitten op specifieke plaatsen: Op Arginine (R) en Lysine (K)

Question 4

Waarvoor wordt massa spectrometrie gebruikt?

Answer 4

Massa spectrometrie kan:
- Eiwit identificeren
- Eiwit kwantificeren (iets lastiger)
- Bindende eiwitten identificeren
- Eiwitmodificaties identificeren (Fosforylering, acetylering, methylering)

Question 5

Hoe gaat de massa spectrometrie bij eiwit interacties?

Answer 5

Maak een lysaat (Extract) van de cellen en isoleer het eiwit of eiwit-DNA complex waarin geïnteresseerd is.

Elueer (Uitwassen) alle eiwitten die interactie hebben met dit eiwit (complex)

Analyseer welke peptiden aanwezig zijn
Zo worden de bindende eiwitten geïdentificeerd

Question 6

Wat is het voordeel van alle interactief bij massa spectrometrie om het in 1 figuur te zetten?

Answer 6

Door alle interacties in 1 figuur te zetten (Zoals bij massa spectrometrie) kan er meer te weten worden gekomen over de complexe regulatiecircuits in cellen

Dit kan weer worden gebruikt om genexpressie profielen te begrijpen

Question 7

Hoe kan er met massa spectrometrie eiwit modificaties worden geïdentificeren?

Answer 7

Eiwit mengsel -> Trypsine digestie -> Verrijk voor fosfopeptiden -> Identificeer met behulp van massa spectrometrie

Question 8

Wat doen metabolomics?

Answer 8

Analyseert welke metabolieten voorkomen, bijvoorbeeld in het bloed

Metaboloom: Totale set metabolieten (Bijvoorbeeld suikers, nucleotiden, aminozuren)

Question 9

In welke 5 stappen kan een metaboloom in kaart worden gebracht?

Answer 9

1) Sample preparation: Eventueel zuiveringsstap
2) Massa spectrometrie
3) Identificatie met behulp van een computer
4) Herkennen van een patroon
5) Wat is de biomarker?

Question 10

Waarom is het mRNA niet altijd voorspellend voor eiwit(activiteit)?

Answer 10

Omdat het niet alleen voor de eiwit activiteit zorgt, maar ook voor de regulatie van:
- Eiwitmodificaties
- Eiwitstabiliteit
- Translatie

Question 11

Hoe gaat de regulatie van translatie?

Answer 11

1) Regulatie van miRNA transcriptie
2) Drosha knipt het tot pre-miRNA
3) Transport naar cytoplasma
4) Dicer knipt het tot miRNA
5) 1 streng wordt ingebouwd in RISC complex
6) miRNA zorgt voor specificiteit, eiwitcomponenten zorgen voor repressie van translatie of mRNA afbraak

Question 12

Wat is het belang van microRNA op kanker?

Answer 12

miRNA beïnvloedt de expressie van kanker gerelateerde genen, bijvoorbeeld MiR16. Bijna de helft van alle onderzoek richt zich op kanker. Meerdere voorbeelden van directe beïnvloeding van kanker-gerelateerde genen

miR-16 komt verlaagd tot expressie in aantal tumoren. Het reguleert BCL2
Minder miR-16 zorgt voor meer BCL2, waardoor de apoptose wordt geremd

Ook zorgt minder miR-16 voor meer Cdc25A, waardoor er progressie is van de celcyclus

Question 13

Hoe kan de expressie van miRNAs worden bepaald?

Answer 13

Met microarrays en NGS kan de expressie van honderden MiRs tegelijkertijd worden bepaald.

miRNAs kunnen net als bij mRNA’s expressieprofielen, geanalyseerd worden

Goede diagnostische en prognostische waarde
Combinatie met mRNA microarrays/sequencings, proteomics en metabolomics geeft zeer veel informatie

Alle technieken zijn duur, dus uiteindelijk zal voor een relatief goedkope combinatie gekozen worden, nog niet duidelijk welke dat zal worden

Question 14

Hoe worden korte RNAs gebruikt in onderzoek?

Answer 14

dsRNA in de cel

Dicer protein complex knipt het in kleine stukjes RNA (siRNAs) -> 21-25 nt lang

siRNAs worden ingebouwd in het RISC protein complex
RISC complex gaat dsRNA in stukken knippen

Korte RNA’s gaan in RISC complex en RISC complex kan nu mRNA afbreken waartegen het korte RNA gericht is

Dus door specifieke siRNA in de cel te brengen kunnen specifieke stukken mRNA afgebroken worden

Question 15

Hoe kan er worden ingegrepen in de groei van kankercellen via mRNA?

Answer 15

• Geen mRNA -> Geen eiwit
• siRNAs zorgen voor mRNA afbraak (Dit wordt ook wel RNA interferentie genoemd)
• RNA interferentie (RNAi) kan voorkomen dat eiwitten die essentieel zijn voor de groei van kankercellen tot expressie komen

Question 16

Hoe gaan de RNAi screens om de achilleshiel van kankercellen te vinden?

Answer 16

siRNA voor veel genen, elk in een aparte celkweek. In elke celkweek is nu 1 gen uitgeschakeld

Analyseer het effect van de behandeling en kijk welke siRNAs celdood geven voor kankercellen, maar niet voor normale cellen

Controleer dan of er al remmers voor deze targets aanwezig zijn. Controleer of die remmer inderdaad werkt in de cellen en diermodellen

Question 17

Hoe kan er worden ingegrepen worden in de groei van kankercellen via het eiwit?

Answer 17

CML philadephia chromosoom:
- Het remmen van de kinase activiteit van BCR-ABL met imantibin

Question 18

Wat is een nadeel van het ingrijpen in de groei van kankercellen met imantinib/een eiwit?

Answer 18

• Specificiteit van dergelijke remmers is vaak een probleem
• Er kan gemakkelijk resistentie ontstaan
• Het zal vaak niet lukken om een geschikte remmer te vinden

Question 19

Wat zijn de voordelen van RNAi?

Answer 19

• Eenvoudig toe te passen op elk willekeurig gen waarvan de sequentie bekend is
• Specifiek
• Door het mRNA op verschillende plekken met siRNAs aan te pakken zal resistentie niet gemakkelijk ontstaan
• Geschikt voor hoge doorvoer analyses

Question 20

Wat zijn de nadelen van RNAi?

Answer 20

• Kan alleen gebruikt worden om expressie te remmen
• Nog niet bekend hoe siRNA in gewenste cellen gebracht kunnen worden