2.5 Next Generation Sequencing: Moderne Techniek voor het opsporen van Mutaties

Question 1

Waarvoor wordt NGS gebruikt?

Answer 1

Voor de detectie van:
- Kleine mutaties (Silent mutatie, missense mutatie, nonsense mutatie)
- Deleties en amplificaties
- Translocaties en fusiegenen

Question 2

Hoe wordt NGS toegepast in moleculaire pathologie?

Answer 2

• Differentiaal diagnostiek
• Therapiekeuze
• Clonaliteitsanalyse
• Oncogenetica (erfelijke tumorsyndromen) in samenwerking met Klinische Genetica
• Weefselidentificatie

Question 3

Hoe wordt genetische informatie opgebouwd?

Answer 3

Genetische informatie ligt in het DNA
22.000 genen
Het volledige humane genoom wordt met 3 miljard basen beschreven

Question 4

Hoe zit het met de complementariteit in DNA?

Answer 4

A-T: 2 waterstofbruggen
C-G: 3 waterstofbruggen (Stabieler)

Question 5

Hoe gaat PCR?

Answer 5

Polymerase Chain Reaction:
1) Denaturatie bij 90-95 °C. De strengen van het template DNA splitsen
2) Hybridisatie bij 50-60 °C, de primer hecht aan het template DNA
3) Elongatie bij 72 °C. Taq-polymerase plaatst nieuwe nucleotiden

Question 6

Wat is thermus aquaticus?

Answer 6

• Bacterie die pas doodgaat bij 120 °C
• PCR
• Synthetiseren DNA

Question 7

Wat is NGS?

Answer 7

2 soorten NGS:
- Single Molecule: Sequentie van afzonderlijke moleculen wordt bepaald en niet van een mix van verschillende moleculen
- Massively Parallel: Van een zeer groot aantal afzonderlijke moleculen wordt de sequentie in parallel (tegelijkertijd) bepaald

Question 8

Wat zijn NGS methodes?

Answer 8

• Amplicon Enrichment (IonTorrent)
• Hybridization Capture (Illumina)

Question 9

Wat is een Amplicon Enrichment?

Answer 9

Een specifiek deel van het genoom wordt gesequenced.
Aan PCR primers kan een label gehangen worden die mee worden gesequenced waardoor dezelfde gebieden bekeken kunnen worden van verschillende individuen

Efficiënt, maar er wordt wel maar steeds 1 fragment uit een bepaald gebied gesequenced

Question 10

Wat is Hybridization Enrichment?

Answer 10

DNA wordt in kleine fragmenten gesplitst voordat het geamplificeerd wordt.
Het wordt op adapters aangebracht voor latere sequencing. Interessante gebieden worden eruitgehaald (Capture) en gesequenced worden

Minder efficiënt, maar er kunnen wel meerdere fragmenten van een bepaald gebied gesequenced worden

Question 11

Hoe gaat het sequencen?

Answer 11

Met behulp van adapters worden moleculen gebonden aan flowcell. Op het flowcell worden de DNA fragmenten geamplificeerd (Vermeerderd)

De daadwerkelijke sequencing vindt plaats tijdens de synthese

Elke nucleotide heeft zijn eigen kleur. Door een fragment van de sequenties te vergelijken kan er gezien worden van welk gen het afkomstig is. Als de sequentie van verschillende patiënten vergeleken moet worden kan dit met een barcode (DNA barcoding)

Question 12

Wat is coverage (Deep sequencing)?

Answer 12

Aantal malen dat een base positie bepaald is. Hoe hoger de coverage, hoe dieper gesequenced (Nauwkeuriger)

Bij whole genome sequencing WES of Whole Exome Sequencing <100 keer diep

Bij targeted sequencing 500 keer - 10.000 keer diep

Question 13

Wat is variant allel frequentie?

Answer 13

Aantal malen dat een variant op een specifiek positie gevonden is ten opzichte van de referentie

Afhankelijk van:
- Gen
- Tumorcelpercentage

Var_Cov gedeeld door Coverage

Question 14

Wat is het verschil tussen oud: Sanger Sequencing (PCR) vs. nieuw: NGS?

Answer 14

Sanger Sequencing:
- Mix van moleculen
- 1 fragment/analyse
- Output max. 1000 basen
- Veel DNA nodig
- Lage gevoeligheid (20%)
- Poolen niet mogelijk
- Eenvoudige analyse

NGS:
- Single molecuul
- Duizenden fragmenten/analyse
- Output 1-20 miljard basen
- Weinig DNA nodig (20 ng)
- Hoge gevoeligheid (1-2%)
- Poolen van samples (Barcode)
- Bio-Informatica vereist