3.3 Chromosomale Afwijkingen bij Leukemie

Question 1

Hoezo is cytogenetica relevant?

Answer 1

• Voor de diagnose
• Voor de prognose
• Vertelt wat over de reactie op chemotherapie
• Vertelt wat over de leukemogenesis en hematopoëse
• Het helpt met het identificeren van betrokken genen, inzicht in leukemogenesis en hematopoïesis resulteert in mogelijke behandeling keuzes

Question 2

Hoe kunnen chromosomale afwijkingen worden gedetecteerd en geïdentificeerd?

Answer 2

Klassieke cytogenetica:
- Banderingstechnieken

Moleculaire cytogenetica:
- Fluorescente In-situ Hybridisatie (FISH)
- Array (SNP array)

Moleculaire diagnostiek:
- RQ-PCR (Fusie genen)
- Q-PCR
- Sequencing (Sanger -> NGS)

Question 3

Wat is de eerste stap van cytogenetisch onderzoek?

Answer 3

Kweken

Er wordt bloed (Met blasten) of beenmerg gebruikt. Er worden hier groeifactoren aan toegevoegd. Dit duurt 1-2 dagen.
Met colcemid (Mitose blok) wordt de deling stopgezet en wordt er een hypotone oplossing toegevoegd waardoor de cellen kapot gaan

De cellen worden gefixeerd met methanol-azijnzuur waardoor het membraan ontvet wordt. Bij het druppelen van de suspensie op het gaasje zullen de membranen breken

Laatste fase is bandering (G-/R-/Q-bandering). Er is hierna een streepjescode op het DNA te zien

Question 4

Wat zijn numerieke chromosomale afwijkingen?

Answer 4

• Winst: Van een compleet chromosoom (+8)
• Verlies: Van een compleet chromosoom (-7)

Question 5

Wat zijn gebalanceerde structurele chromosomale afwijkingen?

Answer 5

• Translocatie: Uitwisseling van terminaal chromosomaal segment (t(9;22))
• Inversie: Binnen een chromosoom
• Insertie

Question 6

Wat zijn niet gebalanceerde structurele chromosomale afwijkingen?

Answer 6

• Deletie (Deel van een chromosoom)
• Amplificatie (Duplicatie, dmin, hsr)
• Niet-gebalanceerde translocatie
• Gen mutatie (Op niveau van baseparen)

Question 7

Waaruit bestaat een chromosoom?

Answer 7

Centromeer met erboven een korte arm P en eronder de lange arm Q

Question 8

Wat is een terminale deletie?

Answer 8

Deletie aan het uiteinden van een chromosoom

Question 9

Wat is interstitiële deletie?

Answer 9

Deletie aan het midden van een chromosoom (in een arm -> 5q bijvoorbeeld)

Question 10

Wat is translocatie?

Answer 10

Er zijn 2 stukken chromosomaal materiaal uitgewisseld (13 en 15 en 21 en 22 bijvoorbeeld)

Question 11

Wat is inversie?

Answer 11

Waarbij een stuk chromosoom 180° is gedraaid

Paracentrisch: Aan een P of Q arm (Binnen de arm -> Inv(3))
Pericentrisch: Aan een centromeer (Rondom het centromeer -> Inv(16))

Question 12

Hoe wordt een karyogram beschreven (Bijvoorbeeld: 45, XY, -7[10] t(9;11)(p22,q23)?

Answer 12

• Chromosomenaantal
• Geslacht
• Bijzonderheden

Er is uit op te maken dat het chromosoom 7 in 10 metafasen mist bij mannelijk karyotypen en dat het 1 chromosoom mist (45 in plaats van 46)

Breekpunten kunnen aangegeven worden, dus:
- Translocatie op chromosoom 9 en 11
- Bij chromosoom 9 op de p-arm op plek 22
- Chromosoom 11 op de q-arm op plek 23

Question 13

Wat zijn slechte risico afwijkingen bij AML?

Answer 13

Complex karyotype -> Slechte prognose

Monosomaal karyotype (Verlies van 2 autosomen, dus verlies van 2 monosomieën (Geen X of Y) of er is sprake van 1 monosomie en een structurele afwijking) -> Zeer slecht risico, Overall Survival 7%

Slechte overleving ondanks behandeling met allogene transplantatie
Andere onbekende afwijkingen

Question 14

Wat is FISH?

Answer 14

Fluorescence In-Situ Hybridization

Het is een methode om mutaties zichtbaar te maken. Het is gericht op een specifieke target (Wordt klaargemaakt in-situ)

Question 15

Wat is een probe selectie?

Answer 15

Met een probe wordt aangetoond of het stukje DNA aanwezig is bij de patiënt (Dan zal dat stukje oplichten)

Question 16

Welke 2 methoden zijn er bij FISH?

Answer 16

• De metafase FISH
• De interfase FISH

Question 17

Wat is de metafase FISH?

Answer 17

FISH op gekweekte (delende) cellen:
- Lymfocyten
- Leukocyten (Beenmerg/bloed)
- Solide tumoren

Question 18

Wat is interfase FISH?

Answer 18

FISH op kernen van niet/slecht delende cellen:
- Snelle analyse
- Beoordeling op basis van aantal signalen (Eventueel fusie-signaal, of break-apart probes)

Question 19

Wat zijn de voordelen van FISH (5)?

Answer 19

• Detectie van microdeleties
• Breekpunt detectie en verbetering
• Detectie van cryptische translocaties en complexe genoom veranderingen
• Snelle diagnostische detectie op kernen in de interfase
• Demonstratie van kleine hoeveelheid van afwijkende cellen

Question 20

Wat zijn de nadelen van FISH (3)?

Answer 20

• Gelimiteerde sensitiviteit
• Geeft alleen antwoord op de gestelde vragen
• Beperkte target locaties om te onderzoeken (vanwege kleurbeperking)

Question 21

Wat zijn fusie probes?

Answer 21

Het is er om translocatie aan te tonen. Als er geen translocatie is wordt er 2x groen en 2x rood gezien

Als er wel een translocatie is wordt er 1x geel (Het fusie signaal), 1x rood en 1x groen gezien

Het kan ook vals positief zijn als bijvoorbeeld het rode signaal boven de groene ligt door de 3D-structuur van het DNA. Ziet er dan onterecht uit als een geel signaal

Question 22

Wat zijn break-apart probes?

Answer 22

Stukken gaan uit elkaar als er een breuk tussenkomt

Geen translocaties: 2 fusies, dus 2x geel
Wel translocaties: 1 fusie, 1x geel, 1x groen, 1x rood

Question 23

Hoezo vormt MM een probleem bij cytogenetisch onderzoek?

Answer 23

Multipel Myeloom: Moeizaam chromosomen onderzoek

Laag (0.1-10%) percentage afwijkende cellen in beenmergaspiraat. Afwijkende cellen delen niet of nauwelijks onder lab condities. Hierdoor wordt er vaak een normaal karyotype met afwijkende FISH op interfase kernen gezien

Het aantal afwijkingen zijn chromosomaal niet zichtbaar (Cryptisch)

Question 24

Wat is een oplossing voor het MM probleem?

Answer 24

Hoger percentage plasmacellen -> Zuivering van de plasmacellen

Question 25

Hoe gaat de zuivering van plasmacellen?

Answer 25

Rode bloedcellen verwijderen met rode bloedcel lysis

Zuivering met anti-CD138 kit (Stem Cell Technologies)

Question 26

Wat is SNP array?

Answer 26

Single Nucleotide Polymorphism
Een genoom kan nu breed bekeken worden en worden de fouten met kleine resoluties ook in kaart gebracht

Question 27

Hoe wordt SNP uitgevoerd?

Answer 27

Met 850.000 probes.
Er wordt getest of iemand voor een bepaalde SNP homozygoot of heterozygoot is

Deleties en duplicaties kunnen makkelijk worden opgespoord

Door de allelen kleurtjes te geven kan er worden gekeken naar de verhoudingen

Question 28

Hoe wordt SNP geanalyseerd?

Answer 28

Met behulp van LogR en B-allele Frequency. Verschillende %, verschillende klonen.

LogR is een maat voor het aantal kopieën die aanwezig zijn

B-allele Frequency vertelt iets over de frequentie van SNP

Question 29

Wat is de analyse van SNP?

Answer 29

Normaal:
- LogR: 2
- Allele frequency: AA, AB, BB

Deletie:
- LogR: 1
- Allele frequency: A-, B-

Duplicatie:
- LogR: 3
- Allele frequency: AAA, BBB, AAB, ABB

Verlies van heterozygositeit (LOH):
- LogR: 2
- Allele frequency: AA, BB

Question 30

Wat is het verschil tussen FISH en SNP?

Answer 30

FISH kan niet LOH opsporen en SNP Array wel

SNP kan geen translocaties opsporen en FISH wel