HC 3.7: Proteomics, metabolomics, miRNA's en RNAi screens Flashcards
de hoeveelheid eiwit is een betere maat voor genexpressie dan mRNA. maar waarom kijken we dan toch vaak naar mRNA en niet naar eiwitten?
omdat het kijken naar mRNA een stuk makkelijker is dan kijken naar eiwitten. het kijken naar mRNA is een simpelere techniek.
maar kijken naar eiwitten is wel mogelijk dankzij nieuwe en verbeterde technieken, maar het gaat nog niet zo snel en gemakkelijk als kijken naar mRNA.
mogelijkheden voor analyse van eiwitten: eiwit-identificatie, eiwit-modificatie en eiwit interactie (met welke partners doet het eiwit iets)
eiwit identificatie met massa spectrometrie:
- we beginnen met een eiwit of een aantal eiwitten
- eiwitten zijn meestal vrij groot en die kunnen we met deze technologie niet goed analyseren
- daarom breken we het eiwit eerst af in kleinere stukjes, met behulp van het enzym Trypsine
- vervolgens kunnen we die kleinere stukjes analyseren aan de hand van massa spectrometrie
- die data gaan we vergelijken met data uit de database over de Humane Genoom sequentie
- we vergelijken dus al die info en vervolgens kunnen we dan het eiwit identificeren
Trypsine:
- is een enzym dat in onze darmen voorkomt en daar helpt het met de afbraak van eiwitten tot aminozuren die vervolgens in het lichaam opgenomen kunnen worden
- trypsine knipt eiwitten op specifieke plekken: bij Arginine (R) en Lysine (K)
- je krijgt dan dus allemaal fragmenten die beginnen met een R of een K en eindigen waar de volgende K of R is
- je krijgt dus kortere stukjes van het eiwit waarin we geïnteresseerd zijn
- die fragmenten noemen we tryptische fragmenten
hoe werkt een massa spectrometer?
- we hebben dus een mengsel met allemaal tryptische fragmenten
- die peptides worden vervolgens op een sample plaats aangebracht
- daar wordt met een laser een hele korte puls op geschenen
- door die puls raakt een deel van de peptides positief geladen, lading 1+
- omdat de sample plaat ook positief is geladen willen die positieve peptides weg van die plaat richting een negatief geladen plaat
- door die laser op een bepaalde manier te richten, raakt een deel van die peptides in de gas fase en die vliegen weg naar de negatieve plaat
- in die negatieve plaat zit een gat waar die gas vormige peptides dan doorheen kunnen vliegen
- ze worden versneld en vliegen door totdat ze een detector raken
- iedere keer als er een molecuul op die detector komt, wordt dat omgezet in een signaal
- hoe hard ze aankomen op die detector is afhankelijk van de lading en de massa
- maar ze zijn allemaal lading 1+, dus afhankelijk van de massa ontwikkelen ze een bepaalde snelheid
- we kunnen door al die signalen te bekijken en de tijd waarop ze aankomen dus bereken welke massa ze hebben
bij een massa spectrometer komen kleine moleculen het snelst aan. we krijgen dus een massa spectrogram waarmee we dus te zien krijgen wat de massa is van een hele reeks peptiden. en omdat we de massa weten van aminozuren, zouden we in principe kunnen uitrekenen welke aminozuren er allemaal in die peptides zitten.
–> we hebben dus het mengsel van eiwitten omgezet naar een lijst met molecuulmassa’s van alle peptides
de andere helft gebeurt in de computer.
- in de database van het menselijke genoom worden alle mogelijke eiwitten berekend
- vervolgens worden van alle mogelijke eiwitten, alle mogelijke tryptische fragmenten bepaald
- daar krijgen we dan een lijst uit met allemaal berekende mogelijke molecuulmassa’s
- en zo’n molecuulmassa hoort dan bij een bepaald eiwit waar zo’n peptide van afkomstig is
vervolgens kunnen we dan die molecuulmassa’s van die peptiden die we gemeten hebben vergelijken/matchen met de door de computer berekende molecuulmassa’s, dan hebben we…
een eiwit geïdentificeerd
gebruik van massa spectrometrie:
massa spectrometrie kan:
- eiwit identificeren
- eiwit kwantificeren (hoeveelheid van het eiwit meten)
- bindende eiwitten identificeren
- eiwitmodificaties identificeren
massa spectrometrie eiwit interacties:
- stel we hebben het eiwit p53 en we willen weten welke eiwitten allemaal binden aan dat p53 eiwit
- we hebben een mengsel van allerlei eiwitten, waaronder een complex van p53 met een ander eiwit daaraan gebonden
- en we willen dan dus weten welk ander eiwit aan dat p53 zit gebonden
- we beginnen met een antilichaam wat specifiek bindt aan dat p53 eiwit toe te voegen
- we krijgen dan dus een complex van p53, dat eiwit wat daaraan gebonden zit en het antilichaam
- die antilichamen met daaraan het complex kunnen we vervolgens weer uit de oplossing halen, met behulp van beads/bolletjes waar dat antilichaam aan bindt
- we wassen dan dat antilichaam die aan p53 bindt weg, waardoor we alleen p53 overhouden met daaraan een eiwit gebonden
- vervolgens kan dat weer in de massa spectrometer gedaan worden, kunnen die eiwitten weer geknipt worden en kunnen we identificeren welke eiwitten er gebonden zaten aan het p53
massa spectrometrie en eiwit modificatie:
- eiwitten kunnen een inactieve of actieve vorm hebben
- het verschil tussen actieve en inactieve vorm is vaak een heel klein chemische groepje dat op dat eiwit zit, vaak een fosfaat groepje
- stel we willen weten welke andere eiwitten allemaal fosfaat groepen krijgen door het eiwit BCR-ABL, dus eigenlijk: welke eiwitten worden geactiveerd door BCR-ABL?
- we beginnen weer met een eiwit mengsel, van eiwitten met het BCR-ABL gen en eiwitten zonder dat gen (en we willen dan dus het verschil weten tussen welke gesfosforyleerd zijn en welke niet)
- m.b.v. trypsine maken we weer die peptiden
- we kunnen er dan voor zorgen dat we vooral peptiden krijgen met fosfaat groepen er op, je kan dus verrijken voor fosfopeptiden
- vervolgens kunnen we dat weer identificeren m.b.v. massa spectrometer
hoe identificeren we de fosfaat groepen met massa spectrometer bij eiwit modificatie?
- stel we hebben molecuul M met een molecuulmassa van 2911
- we willen dan weten of die peptide ook gefosforyleerd is
- een fosfaatgroep is precies een molecuulgewicht van 80
- we kunnen dan dus kijken naar een piek op 2911 waar geen fosfaat groep op zit en naar een piek van 2991 waar dus wel een fosfaat groep op zit
- door te vergelijken hoeveel van die met fosfaat en zonder fosfaat er zijn, kunnen we achterhalen welk deel van de eiwit moleculen zo’n fosfaat groep heeft
- als we bijv. vinden dat met BCR-ABL er een piek is van 2991 en zonder BCR-ABL een piek van 2911, dan weten we dat dat een eiwit is wat gefosforyleerd wordt door BCR-ABL gen
als we weten dat een eiwit actief wordt door bijv. een fosfaat groep die er op wordt gezet, dan kunnen we meten welk deel van dat eiwit die fosfaat groep heeft en dus actief is.
maar we kunnen ook kijken naar de activiteit van het eiwit zelf, dat kunnen we doen door te kijken naar allerlei metabolieten
metabolomics:
- analyseert welke metabolieten voorkomen en op basis van welke metabolieten aanwezig zijn, kunnen we dus misschien iets bepalen over wat de activiteit van eiwitten is in het lichaam
- en omdat die metabolieten meestal ergens in de bloedbaan voorkomen, kwam er het idee dat we misschien aan de hand van de metabolieten die worden gevonden in de bloedbaan kunnen achterhalen of er een tumor aanwezig is in het lichaam
kan metabolomics dus een marker zijn voor de aanwezigheid van een tumor?
- het idee daarachter is, is dat 1 van de hallmarks van tumoren is, dat ze deregulatie krijgen van hun metabolisme
- en als er dus heel veel cellen met een gedereguleerd metabolisme zijn, dan kun je dat misschien wel zien door die metabolieten die in het bloed aanwezig zijn
hoe werkt de metabolomics?
- de metabolieten zijn al klein genoeg, dus ze hoeven niet nog kleiner te worden gemaakt
- het mengsel kan dus meteen in de massa spectrometer gedaan worden
- weer dezelfde stappen, dus met laser positief geladen maken, dan laten vliegen, versnellen, we meten hoelang ze er over doen om bij de detector aan te komen
- we bepalen de molecuulmassa
- en we kunnen dan gewoon identificeren welke moleculen het zijn
- of we kunnen gaan vergelijken tussen een kankerpatiënt en een niet-kankerpatiënt met welke pieken we zien
- we gaan gewoon kijken welk patroon van pieken overeen komt met het hebben van die tumor
- en dan kunnen we misschien dat patroon gaan gebruiken om dat soort tumoren te gaan opsporen nog voordat die tumor problemen geeft
