HC 3.3: Cytogenetische afwijkingen

Question 1

detectie en identificatie van chromosomale afwijkingen:

Answer 1

• klassieke cytogenetica (banderings technieken)
• moleculaire cytogenetica (FISH en SNP array)
• moleculaire diagnostiek

Question 2

om chromosomen te kunnen analyseren zijn delende cellen nodig. daarvoor moet het beenmerg of bloed van een patiënt in kweek worden gebracht:

Answer 2

• er wordt kweekmedium gebruikt, waaraan groeifactoren zijn toegevoegd, specifiek voor de cellijn waarin de leukemie zich bevindt
• die kweek duurt 1-2 dagen
• vervolgens wordt die kweek gestopt, precies op het moment dat de cellen nog in het midden van de celdeling zitten
• dit wordt gedaan door het toevoegen van een mitose blok, waardoor de cellen stil komen te staan in de metafase
• vervolgens een behandeling met een hypotone vloeistof, zodat de cellen opzwellen
• de cellen worden ook nog behandeld met een fixatief, waardoor het celmembraan uithardt
• daarna wordt dat op preparaat glaasjes aangebracht

Question 3

na de kweek en zodra de glaasjes dus zijn gemaakt, worden banderings technieken toegepast.

Answer 3

er zijn verschillende technieken die ieder een eigen unieke banderingspatroon geven. ieder chromosoom krijgt een specifiek uniek patroon.

Question 4

bij de analyse van chromosomen gaan we opzoek naar chromosomale afwijkingen:

Answer 4

• numerieke afwijkingen (winst van een compleet chromosoom of verlies van een compleet chromosoom)
• structurele afwijkingen (afwijkingen in een deel van een chromosoom)

Question 5

gebalanceerde structurele chromosoom afwijkingen:

Answer 5

al het DNA is nog steeds aanwezig, maar niet allemaal op de juiste plek of in de juiste oriëntatie binnen het chromosoom
- translocatie
- inversie
- insertie

Question 6

niet-gebalanceerde structurele chromosoom afwijkingen:

Answer 6

er is sprake van winst of verlies van een deel van een chromosoom.
- deletie
- amplificatie
- niet-gebalanceerde translocatie
- gen mutatie

Question 7

het chromosoom:

Answer 7

• DNA dat met behulp van allerlei eiwitten is opgerold
• het chromosoom bestaat meestal uit een korte arm (p arm)
• en uit een lange arm (q arm)
• die twee armen worden gescheiden door een centromeer

Question 8

terminale deletie:

Answer 8

een deletie (verlies van een stuk chromosoom) aan het einde van een chromosoom

Question 9

interstitiële deletie:

Answer 9

een deletie in het midden/in een arm van een chromosoom

Question 10

inversie:

Answer 10

er ontstaan 2 breuken in het chromosoom en het stuk tussen die breuken draait 180 graden en wordt dan weer ‘vastgeplakt’

Question 11

paracentrische inversie:

Answer 11

een inversie die in een chromosoom arm plaatsvindt

Question 12

pericentrische inversie:

Answer 12

een inversie rondom het centromeer, wat inhoudt dat het stuk chromosoom wat draait, het centromeer bevat

Question 13

een complex karyotype geeft een slechte prognose/risico bij AML. wat is een complex karyotype?

Answer 13

meer dan 3 verschillende chromosoom afwijkingen bij een patiënt in tumorcellen

Question 14

maar het hebben van een monosomaal karyotype heeft een nog slechtere prognose dan het complex karyotype:

Answer 14

monosomaal karyotype houdt in:
- twee monosomieën (geen X of Y) of
- één monosomie (er ontbreekt een chromosoom) én een structurele afwijking

Question 15

karyotypering is een handige techniek, want je kan alle chromosomen in 1 keer bekijken, maar de resolutie is wel beperkt. een chromosoom afwijking moet wel zo’n 5-10 Mb groot zijn, anders is het niet te zien met karyotypering. en we weten dat sommige afwijkingen kleiner zijn dat dat.

Answer 15

om die afwijkingen toch in beeld te krijgen, want dat is belangrijk, gebruiken we aanvullende moleculaire cytogenetische technieken, waaronder FISH

Question 16

FISH:

Answer 16

• je moet van te voren weten naar welke regio/target gekeken moet worden
• je kiest dan voor die regio een probe, gelabeled met een fluoriscerend label
• je brengt de probe en het DNA van de patiënt bij elkaar, je zorgt dat beide tegelijk gedenatureerd worden, dus enkelstrengs worden
• en daarna zullen die enkelstrengs probes gaan zoeken naar complementaire DNA strengen, wat dus het DNA van de patiënt kan zijn of een stuk complementair probe
• wanneer de probe wordt ingebouwd in het DNA van de patiënt
• en dan kan het signaal wat aan die probe vast zit, middels een fluorescentie microscoop zichtbaar maken

Question 17

meestal zijn de labels bij FISH rood of groen. daarom dus belangrijk dat mensen die dit analyseren niet kleurenblind zijn.

Question 18

hoe kan je FISH verder gebruiken?

Answer 18

• je kan de metafase analyseren, de metafase FISH, waarvoor je delende cellen nodig hebt.
• lymfocyten, leukocyten (beenmerg/bloed), solide tumoren
• maar voordeel van FISH is, dat je ook kan kijken naar cellen die niet aan het delen zijn, de interfase FISH
• interfase FISH is bij kernen van niet/slecht delende cellen
• deze manier van FISH is handig wanneer je gewoon snel een analyse en uitslag nodig hebt

Question 19

bij interfase FISH kan je niet meer zien waar de probes gelokaliseerd zijn in het chromosoom, maar je kan wel analyseren hoeveel signalen er aanwezig zijn. en op basis van het aantal signalen kan je conclusies trekken over de aanwezigheid van deleties of duplicaties en soms ook over de aanwezigheid van translocaties.

Question 20

waarvoor gebruiken we FISH?

Answer 20

• detectie van microdeleties
• detectie van breekpunten en definiëren van breekpunten
• detectie van cryptische translocaties en complexe chromosoom afwijkingen
• snelle diagnostiek op interfase kernen
• aantonen van een kleine groep van afwijkende cellen

Question 21

beperkingen/nadelen van FISH:

Answer 21

• beperkte sensitiviteit
• je krijgt echt alleen maar antwoord op de vraag die je hebt gesteld
• je kan niet heel veel verschillende targets tegelijk onderzoeken

Question 22

probleem met Multipel Myeloom:

Answer 22

• MM: maligniteit van de plasma-cellen
• die plasma-cellen van het MM komen heel moeilijk tot deling
• laag percentage afwijkende cellen in beenmerg preparaat
• resultaat: vaak een normaal karyotype, met afwijkende FISH op interfase kernen
• er zijn ook een aantal afwijkingen van het MM die middels karyotypering en FISH niet zichtbaar zijn
• 1 manier die we in het lab gebruiken om die afwijkingen toch aan te tonen, is zuivering van de plasmacellen, dat doen we om een hoger percentage afwijkende plasmacellen te krijgen

Question 23

zuivering van plasma-cellen:

Answer 23

• er vindt rode bloedcel lysis plaats in het beenmerg, waardoor de rode bloedcellen verwijderd worden
• daarna wordt gebruik gemaakt van een zuiveringskit, met anti-CD138
• CD138 is een marker die op het membraan van cellen tot expressie komt
• bij de zuivering gaan we met magnetische beads, waaraan eiwitten gekoppeld zijn, die precies die marker kunnen binden, plasmacellen vangen
• de overige cellen die in het beenmerg aanwezig zijn worden weggespoeld
• daarna worden die plasmacellen weer losgekoppeld van die magnetische beads en hebben we dus een verrijkte plasmacellen populatie, die onderzocht kan worden in het lab

Question 24

verschillende typen afwijkingen die belangrijk zijn bij MM:

Answer 24

• enkele gebalanceerde translocaties
• deleties (sommige zijn met FISH nog wel lastig vast te stellen)
• amplificaties

Question 25

naast FISH, voor de gebalanceerde translocaties, wordt binnen het lab ook Array gebruikt. de resolutie van Array voor ongebalanceerde chromosoom afwijkingen is namelijk nog veel groter. we kunnen ongebalanceerde afwijkingen zien vanaf 0,15 Mb.

Question 26

SNP (Single Nucleotide Polymorphism):

Answer 26

het is een plek in het genoom, waarbij op 1 base positie, twee verschillende basen kunnen voorkomen, zonder dat dat klinische gevolgen heeft.
Stel we noemen het allel A als er op die plek een G zit.
en we noemen het allel B als er op die plek een A zit.
iemand kan dan homozygoot zijn voor allel A. (AA)
iemand kan heterozygoot zijn voor A en B. (AB)
iemand kan homozygoot zijn voor allel B. (BB)