HC 2.6: Next Generation Sequencing

Question 1

opbouw van DNA in de cel:

Answer 1

• het DNA zit in de celkern, opgevouwen in chromosomen
• die DNA strengen zitten om histonen gewikkeld (die ‘eenheden’ noemen we nucleosomen)
• het DNA bestaat uit veel verschillende genen
• en uiteindelijk, het meest ingezoomd, zien we dat DNA uit basenparen bestaat

Question 2

karyogram van normale cellen:

Answer 2

2 keer 23 chromosomen
en 2 geslachtschromosomen

Question 3

complementariteit bij DNA:

Answer 3

• A tegenover T
• C tegenover G
  A-T met 2 waterstofbruggen aan elkaar gebonden
  C-G met drie waterstofbruggen aan elkaar gebonden

Question 4

van DNA naar eiwit:

Answer 4

• transcriptie, van DNA naar mRNA
• translatie van mRNA naar een eiwit
• iedere 3 nucleotiden in het RNA vormt een aminozuur

Question 5

DNA sequencing:

Answer 5

het bepalen van de volgorde van de 4 nucleotiden/basen, waaruit het DNA molecuul bestaat

Question 6

PCR (polymerase chain reaction):

Answer 6

is een techniek om heel veel extra kopieën te maken van DNA
- iedere cyclus van PCR wordt het aantal DNA, de regio van interesse binnen het DNA, verdubbeld.
1e cyclus: n=2
2e cyclus: n=4
20e cyclus: n> 1 miljoen
Die hoeveelheid aan kopieën is nodig om het DNA te kunnen analyseren.

Question 7

mutatie in DNA:

Answer 7

een mutatie in het DNA, zorgt voor een mutatie in het RNA en dus voor een mutatie van een eiwit.
dit kan uiteindelijk leiden tot een verhoogde of juist verlaagde activiteit van het eiwit

Question 8

tumorcellen en mutaties:

Answer 8

bij tumorcellen is er vaak geen sprake van maar 1 mutatie. het heeft te maken met een opeenvolging van mutaties die zich opstapelen in de cel. uiteindelijk zorgt dat er voor dat een normale cel verandert in een tumorcel

Question 9

type mutaties:

Answer 9

• silent mutatie: wanneer er wel een basenpaar is veranderd en er dus een mutatie is, maar dat het nog steeds codeert voor hetzelfde eiwit, waardoor de mutatie niet opvalt
• missense mutatie: wanneer er een basenpaar is veranderd en er dus een mutatie is, maar dat het daardoor codeert voor een ander aminozuur. de aminozuur volgorde verandert dus
• Nonsense mutatie: wanneer er een basenpaar verandert en er dus een mutatie is, waardoor het aminozuur nu opeens vroegtijdig codeert voor een stop codon. je krijgt hierdoor een eiwit wat niet af is

Question 10

voorbeelden van toepassingen van DNA-sequencing in de oncologie:

Answer 10

• Differentiaal diagnostiek (sommige mutaties zijn specifiek voor een bepaald type tumor)
• Therapiekeuze (steeds meer gerichte therapieën op tumoren met een bepaalde mutatie)
• Clonaliteitsanalyse (bepalen of iets een metastase is of een 2e primaire tumor)
• Oncogenetica (kijken of patiënten erfelijk belast zijn met bepaalde mutaties)
• Weefselidentificatie (bij twijfel over welk biopt bij welke patiënt hoort)

Question 11

Sanger Sequencing:

Answer 11

• je hebt een mix van een DNA template, primers en nucleotiden die fluoriserend gellabeled zijn
• je bouwt die fluoriscerende nucleotiden achter elkaar in op je DNA molecuul/template
• met behulp van een laser kan je die fluoriscerende nucleotiden aflezen
• en zo dus de volgorde van die nucleotiden bepalen

Question 12

verschil en overeenkomsten Sanger Sequencing en Next Generation Sequencing:

Answer 12

• bij NGS wordt net als bij Sanger de nucleotiden volgorde van een stuk DNA bepaald
• maar bij NGS kan je heel veel DNA moleculen in 1 keer sequencen en ook van meerdere patiënten tegelijk tijdens 1 run

Question 13

2 verschillende manieren om te sequencen:

Answer 13

• amplicon based sequencing
• gehydraliseerd verrijkte sequencing

Question 14

amplicon based sequencing:

Answer 14

• op een bepaald gen ligt een bepaald stuk waarin veel bekende mutaties in voorkomen, waarvan we dus willen weten of de patiënt die mutatie heeft
• middels PCR ga je die target regions in het DNA sequencen
• aan die gekopieerde stukken plak je vervolgens adapters vast (zodat je straks nog kan herkennen welk stukje DNA molecuul het oorspronkelijke target region is)
• want er worden vele duizenden target regions tegelijk gesequenced, dus die adapters zijn een herkenningspunt om ze later te identificeren
• nu zijn die stukken DNA dus klaar om te worden gesequenced

Question 15

gehydraliseerd verrijkte sequencing: (hybridization enrichment sequencing)

Answer 15

• je gaat niet eerst PCR doen, je knipt het hele DNA stuk, inclusief dus target region, in kleine stukjes
• aan al die verschillende stukjes worden dan adapters vastgemaakt
• met een prope er aan vast, haal je het stukje DNA van interesse eruit (de rest van de stukjes worden eigenlijk niet gebruikt)
• aan hele kleine magneetjes gaat die prope dan zitten en dan ga je dus uiteindelijk alleen die target regions sequencen

Question 16

hybridization enrichment/based sequencing deel 2:

Answer 16

• je houdt dus van deel 1, je regio’s van interesse over
• aan die fragmenten ga je vervolgens weer adapters toevoegen
• aan die adapters zitten primer locaties en een locatie die aan de flowcel kan binden, wat ook gebeurt
• vervolgens bindt het andere uiteinde van het fragment aan een primer die ook op de flowcel aanwezig is
• er vormt zich dus een soort bruggetje van een fragment
• er vindt dan een PCR reactie plaats, waardoor een tweede DNA molecuul wordt gevormd (parallel aan het bruggetje)
• je krijgt dan twee kopieën (die fragmenten gaan ook weer rechtop staan i.p.v. als bruggetje)
• dit gebeurt meerdere keren, waardoor je uiteindelijk clusters krijgt van dezelfde fragmenten
• vervolgens worden er aan die fragmenten gelabelde nucleotiden ingebouwd en door middel van een foto wordt de nucleotiden volgorde bepaald (alle nucleotiden hebben een bepaalde kleur)

Question 17

gebruik van barcodes:

Answer 17

• om te kunnen achterhalen welk DNA van welke patiënt is, is het belangrijk om de stukken DNA te merken
• daarvoor worden er barcodes toegevoegd aan de adapters

Question 18

data verwerking:

Answer 18

• nadat de sequencer het DNA heeft gesequenced heb je wel een nucleotiden volgorde, maar dan moet dat nog geanalyseerd worden
• daarvoor heb je een bio informatische data verwerking
• die gaat elk stuk nucleotide volgorde vergelijken met het humane genoom
• daarmee kan achterhaald worden van welke mutaties er sprake is

Question 19

waarom vinden we soms niet altijd de mutatie, of heeft een deel van de DNA stukken die gesequenced zijn geen mutatie?

Answer 19

• ieder gen heeft 2 allelen, en vaak is er maar 1 allel gemuteerd, dus vind je ook stukken DNA zonder de mutatie
• daarnaast wordt er bij een biopt ook altijd wat gewoon weefsel meegenomen en niet alleen tumorweefsel. en dus kan bij sequencen dan een stuk normaal weefsel worden gesequenced, waardoor daar geen mutatie in zit

Question 20

coverage:

Answer 20

hoe goed hebben we van een bepaald gen/stuk DNA uiteindelijk bepaald of er een mutatie in zit
(bij een coverage van 2205 reads is de kans groot dat de mutatie gevonden is)
(maar bij een coverage van 1 is de kans juist groot dat de mutatie gemist is)

Question 21

referentie coverage:

Answer 21

hoe vaak het gewone genoom is gevonden

Question 22

variatie coverage:

Answer 22

hoe vaak de mutatie gevonden is

Question 23

aan de hand van de referentie coverage en variatie coverage kan je dus uiteindelijk terug rekenen wat de frequentie is van een mutatie

Answer 23

variatie coverage: 1031
coverage: 2205
van is de variatie frequentie: 1031/2205 * 100% = 46,8%

Question 24

bij een tumorcelpercentage van 25%:

Answer 24

• omdat gemuteerde tumorcellen ook nog een normaal allel hebben, is er maar 12,5% gemuteerde allelen aanwezig
• maar het wildtype allel is dan nog steeds veel meer aanwezig (87,5%)
• en dus 75% gewone cellen

Question 25

we proberen altijd minimaal 20% tumorcel percentage te hebben, omdat je dan meer nauwkeurigheid hebt. zodat je zeker weet dat de mutatie ook echt aanwezig is en dat het geen artefact is van de techniek.

Question 26

tumorcel percentage van 75%:

Answer 26

• de mutatie is dan in 37,5% van de allelen aanwezig
• het wildtype allel is dan 62,5% van de gevallen

Question 27

Variatie Allel Frequentie (VAF):

Answer 27

hoe vaak een variant op een specifieke positie voorkomt ten opzichte van de referentie sequentie.
dit is afhankelijk van:
- gen (oncogen vs tumor-suppressor-gen)
- tumorcel percentage

Question 28

coverage:

Answer 28

• aantal malen dat een base-positie bepaald is
• hoe hoger de coverage hoe beter (‘deeper’) gesequenced

Question 29

WES (Whole Exome Sequencing):

Answer 29

sequencen van alle exonen (coderende regio’s) van alle genen