H3.7: Proteomics, metabolomics, miRNAs, RNAi

Question 1

Proteomics

Answer 1

Bestudeert alle eiwitten van de cel

Question 2

Goede maat voor genexpressie

Answer 2

• Hoeveelheid (actief) eiwit
• Beter dan mRNA, omdat mRNA zorgt voor meer dan alleen de eiwitsynthese

Question 3

Massaspectrometrie gebruiken

Answer 3

• Eiwitten identificeren en kwantificeren (hoogte van piek zegt iets over relatieve hoeveelheid eiwit)
• Bindende eiwitten identificeren (eiwitten die binden aan het eiwit waarin men geïnteresseerd is)
• Eiwitmodificaties identificeren (fosforylering, acetylering, methylering, etc.)

Question 4

Massaspectrometer

Answer 4

• Lange buis met plaat waarop eiwitmengsel wordt aangebracht
• Laser
• Positief geladen eiwitten en schieten weg
• Bewegen richting negatieve pool
• Snelheid waarmee peptide beweegt, is afhankelijk van de grootte: hoe kleiner, hoe sneller

Question 5

Eiwit-identificatie m.b.v. massaspectrometrie

Answer 5

• Mengsel eiwitten
• Kleine stukjes knippen m.b.v. protease (trypsine)
• Analyseren op massa
• Vergelijken met wat je zou verwachten

Question 6

Trypsine

Answer 6

• Protease uit darmen
• Knipt op plek van arginine (R) of lysine (K)
• Peptiden die beginnen met K of R
• Collectie tryptische fragmenten

Question 7

Bindende eiwitten identificeren

Answer 7

• Kijken naar welke eiwitten binden met het eiwit van interesse
• Antilichaam voor eiwit wat gaat binden
• Eiwitten die niet gebonden zijn worden weggewassen
• M.b.v. massaspectrometrie eiwitten in kaart brengen waardoor eiwit-interacties opgehelderd worden

Question 8

Eiwitmodificaties identificeren

Answer 8

• Eiwitmengsel behandelen met trypsine
• Peptiden met fosfaatgroep verrijken
• M.b.v. massaspectrometrie eiwitten identificeren
• Eerste piek is eiwit zonder fosfaatgroep
• Tweede piek is hetzelfde eiwit met fosfaatgroep
• Kijkend naar moleculaire massa van peptiden kan worden achterhaald welke peptiden gefosforyleerd zijn

Question 9

Metabolics

Functie?

Hallmark?

Answer 9

Analyseren welke metabolieten voorkomen

Aanwezigheid van bepaalde metabolieten kan mogelijk worden gebruikt in de vroege detectie van tumoren

Deregulering van energievoorziening, want tumor maakt metabolieten die normaal niet in grote hoeveelheden gemaakt worden

Question 10

Stappen voor in kaart brengen van metaboloom

Answer 10

1. Sample preparation: eventueel zuiveringssta
2. Massaspectrometrie
3. Identificatie m.b.v. computer
4. Herkennen van patroon
5. Wat is de biomarker?

Question 11

Massaspectrometrie x metabolieten

Answer 11

• Ze zijn al klein
• Dus alleen positief laden en dan vliegen ze al tegen plaat aan

Question 12

mRNA zorgt niet alleen voor eiwitactiviteit, maar ook voor

Answer 12

• Regulatie eiwitmodificaties (fosforylering)
• Regulatie eiwit stabiliteit (afbraak bepaalde proteases)
• Regulatie translatie (aantal eiwitten dat van een mRNA molecuul gemaakt wordt) op niveau van microRNA’s

Question 13

MicroRNA’s die regulerende functie hebben voor transleren van mRNA

Answer 13

1. Van DNA wordt een stuk RNA afgeschreven, pre-miRNA
2. Drosha (enzymcomplex) knipt het tot pre-miRNA
3. Transport naar cytoplasma
4. Dicer knipt het complex tot miRNA (kort stukje ds RNA)
5. 1 streng wordt ingebouwd in RISC-complex en kan weer binden aan complementaire sequentie in mRNA
6. miRNA zorgt voor specificiteit. Eiwitcomponenten zorgen voor repressie (vermindering) van translatie of voor meer mRNA afbraak

Question 14

Hoe kan translatie gereguleerd worden?

Answer 14

Door de transcriptie van microRNA te reguleren

Beïnvloedt de hoeveelheid eiwit die er gemaakt wordt en hoeveel er van specifieke eiwitten gemaakt wordt

Question 15

MiRNA-16

Answer 15

Beïnvloedt direct de expressie van kanker-gerelateerde genen

Question 16

Functie MiR-16

Answer 16

Reguleert BLC2

Question 17

Minder MiR-16 (tumoren)

Answer 17

• BCL2 verhoogd
• Apoptose geremd
• Verhoging CDC25A
• Celcyclus progressie

Question 18

Microarrays

Answer 18

Hiermee de expressie van honderden miRNA’s tegelijkertijd bepalen

Question 19

Kleine RNA’s die op een andere manier ontstaan en ook in het RISC complex ingebouwd kunnen worden

Answer 19

• DS RNA komt cel in
• Enzym Dicer knipt RNA in korte stukjes (siRNA)
• Korte stukjes inbouwen in RISC complex
• RISC complex zal ds RNA in stukken knippen
• Korte RNA’s in een cel brengen, in RISC complex terechtkomen
• RISC complex kan mRNA afbreken waartegen het korte RNA gericht is
• Door een specifieke siRNA in de cel te brengen, kunnen specifieke stukken mRNA afgebroken worden

Question 20

Hoe ingrijpen in de groei van kankercellen?

Answer 20

• Eiwitproduct wegvangen
• Remmen van kinase activiteit van BCR-ABL heeft nadelen
• Aangrijpen op mRNA niveau via siRNA’s wat mRNA afbreekt (RNAi)
• RNAi

Question 21

Nadelen remmen kinase activiteit BCR-ABL

Answer 21

Probleem met de specificiteit van kinase remmers waardoor er gemakkelijk resistentie kan ontstaan en wordt het probleem niet bij de bron aangepakt

Question 22

RNAi

Answer 22

Voorkomen dat eiwitten die essentieel zijn voor de groei van kankercellen tot exppressie komen

Question 23

Voordelen RNAi

Answer 23

• Eenvoudig toe te passen op elk willekeurig gen waar men de sequentie van weet
• Dus zeer specifiek
• Niet makkelijk resistentie
• Geschikt voor hoge doorvoer analyses

Question 24

Nadelen RNAi

Answer 24

• Kan alleen gebruikt worden om expressie te remmen
• Men weet nog niet hoe het siRNA in de gewenste cellen ingebracht moet worden
• Grote kans dat het nooit in de kliniek zal worden gebruikt

Question 25

Virussen gebruiken om siRNA’s in de cellen te brengen

Answer 25

Virussen kunnen in het lab gebruikt worden om 1 voor 1 elk gen uit te schakelen

Question 26

Onderzoek van virussen in DLBCL

Answer 26

• GCB DLBCL heeft CARD11 niet nodig
• ABC DLBCL heeft CARD11 wel nodig
• CARD11 is niet apart te remmen
• CARD11 is onderdeel van NFkB pathway
• Als we een andere component in NFkB pathway remmen bijvoorbeeld MALT1 wordt CARD11 ook geremd

DUS: MALT1-remmer is een specifieke remmer bij tumorcellen bij ABC DLBCL