H2.6: Next Generaton Sequencing

Question 1

Menselijk DNA

Answer 1

• 46 chromosomen
• 23 van vader en 23 van moeder
• 22 paar autosomen
• 1 paar geslachtschromosomen
• Chromosomen genummerd o.b.v. lengte en 1 is het langst

Met 3 miljard DNA bouwstenen wordt het volledige humane genoom beschreven, dus in elke diploïde cel zitten 12 miljard bouwstenen

Question 2

PCR stappen

Answer 2

1. ds DNA-molecuul gaat uit elkaar door temperatuurverhoging
2. Temperatuur gaat omlaag en primers die complementair zijn aan een stukje van template DNA worden toegevoegd
3. Basen worden toegevoegd
4. DNA-polymerase wordt toegevoegd
5. Nieuwe DNA-strengen wordt gemaakt

Cyclus herhalen waardoor er meer dan een miljard DNA-moleculen ontstaan

Question 3

Gevolg door temperatuurverhoging

Oplossing

Answer 3

Er moest steeds een nieuwe DNA-polymerase worden toegevoegd, omdat deze kapot ging

Thermus aquaticus: bacteriën die bestemd zijn tegen hogere temperatuur

Question 4

NGS

Answer 4

DNA-volgorde bepalen van een enkel molecuul

Question 5

Vormen van sequencing

Answer 5

• Targeted NGS (amplicon enrichment)
• Hybridization enrichment (hybridisatie verrijking)

Question 6

Targeted NGS (amplicon enrichment)

Answer 6

• Specifiek deel van genoom sequencen
• Aan PCR primers labels ophangen die worden mee gesequenced
• Dezelfde gebieden bekijken van verschillende individuen
• Efficiënt, maar wel continu maar 1 fragment uit een bepaald gebied wat gesequenced wordt

Question 7

Hybridization enrichment (hybridisatie verrijking)

Answer 7

• DNA wordt in kleine fragmenten gesplitst voordat het geamplificeerd wordt
• Adapters aanbrengen voor latere sequencing
• Interessante gebieden worden eruit gehaald (captured) en kunnen gesequenced worden
• Minder efficiënt, maar wel meerdere fragmenten van een bepaald gebied sequencen

Question 8

Flowcell

Answer 8

• M.b.v. adapters worden moleculen hieraan gebonden
• Moleculen binden zo dat ze op afstand zitten van elkaar
• Hierop worden DNA-fragmenten geamplificeerd (vermeerderd) waardoor er clusters van dezelfde moleculen ontstaan

Question 9

Wanneer vindt de daadwerkelijke sequencing plaats?

Answer 9

Tijdens synthese

Question 10

Coverage (deep sequencing)

Answer 10

• Aantal malen dat een base-positie (onafhankelijk) bepaald is
• Hoe hoger coverage des te dieper gesequenced is

Question 11

WGS

Answer 11

• Whole genome sequencing
• <100 maal diep

Question 12

TG

Answer 12

• Targeted sequencing
• 100-1000 fragmenten gesequenced waarbij coverage gebruikt wordt van minimaal 500x

Question 13

VAF

Answer 13

• Variant allel frequency
• Aantal malen dat een DNA-variant op een specifieke positie wordt gevonden t.o.v. referentie DNA
• Afhankelijk van gen en percentage tumorcellen

Question 14

Conventionele sequencing (Sanger)

Answer 14

• Mix van moleculen
• 1 fragment per analyse
• Output max 1000 basen
• Veel DNA nodig
• Geringe hoeveelheid (20%)
• 1 sample (poolen niet mogelijk)
• Eenvoudige analyse

Question 15

NGS

Answer 15

• Single molecule
• 1000 fragmenten per analyse
• Output van 1-20 * 10^9 basen
• Weinig DNA nodig (20 ng)
• Hoge gevoeligheid (1-2%)
• Poolen van samples (barcode)
• Bio-informatie nodig

Question 16

Wat zijn resultaten van NGS?

Answer 16

• Kleine mutatie
• Deleties
• Amplificaties
• Translocaties
• Fusiegenen

Question 17

NGS gebruiken voor

Answer 17

• Differentiaal diagnostiek (diagnose A of B)
• Therapiekeuze (therapie A of B)
• Clonaliteitsanalyse (metastase of 2e primaire tumor)
• Oncogenetica (erfelijke tumorsyndromen) in samenwerking met klinische genetica
• Weefsel identificatie (weefsel van patiënt A of B)