Semaine 5_Analytique des chimies de biochimie générale (automation) Flashcards
Décrire une méthode de dosage de la créatine kinase
Créatine phosphate + ADP —(CK du patient)–> ATP +créatine
ATP + Glucose —(HK)—> G-6-P + ADP
G-6-P + NADP+ —(G6P DH)—> NADPH+ 6-phosphogluconate
En détail:
1. L’enzyme CK du spécimen catalyse le transfert d’un groupe phosphate de la créatine phosphate vers l’ADP pour donner les produits suivants : créatine et ATP.
2. L’ATP formée est utilisée pour produire le glucose-6-phosphate et l’ADP à partir du glucose. Cette réaction est catalysée par l’hexokinase (HK)
3. La glucose-6-phosphate est oxydée par l’enzyme glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6P-DH) avec la réduction simultanée de la NADP pour produire la NADPH et la 6-phosphogluconate. Le taux d’augmentation de l’absorbance à 340/660 nm, due à la formation de la NADPH est directement proportionnel à l’activité de CK dans l’échantillon
Décrire deux méthodes de dosage de bicarbonate
Méthode 1: Enzymatique
(1) HCO3- + PEP —(PEPC)—> oxaloacétate + H2PO4
(2) oxaloacétate + NADH —(Malate DH)—> malate + NAD+
- Le bicarbonate (HCO3-) et le phosphoénolpyruvate (PEP) sont convertis en oxaloacétate et en phosphate lors de la réaction catalysée par le phosphoénolpyruvate carboxylase (PEPC).
- La malate déshydrogénase (MD) catalyse la réduction de l’oxaloacétate en malate avec l’oxydation concomitante de la NADH. Cette oxydation du NADH engendre une diminution de l’absorbance du mélange de réaction mesurée de façon bichromatique à 380/410 nm proportionnelle au contenu du bicarbonate de l’échantillon.
Méthode 2 : Calcul
Indirecte par les appareils à gaz qui calculent la concentration en bicarbonate à partir de l’équation de Henderson-Hasselbalch :
pH = pKa’ + log [HCO3-] / α.pCO2
Décrire deux méthodes de dosage de lactate (N=3 méthodes).
Ce sont toutes des méthode enzymatiques.
Méthode #1: lactate oxyadase sur multianalyseur
(1) Lactate + O2–(Lactate oxydase)–> pyruvate + H2O2
(2) H2O2 + 4-aminoantipyrine + TOOS–(peroxydase)–> Produit violet + 4H2O
le lactate est oxydé par la lactate oxydase en pyruvate et en H2O2. la peroxydase génère après un produit coloré après la réaction du H2O2 + 2-Aminoantipyrine + donneur H+ (TOOS)
Méthode #2: lactate oxyadase sur appareils à gaz
Basé sur l’utilisation de biosenseurs avec une membrane multicouche ;
- Couche externe, perméable au lactate
- Couche moyenne, dans laquelle la lactate oxydase est immobilisée
- Couche interne, perméable au H2O2 généré par la réaction et qui va être détecté à l’électrode. Le signal ampérométrique est proportionnel à la quantité de lactate dans l’échantillon.
Méthode #3: lactate déshydrogénase sur multianalyseur
(1) lactate + NAD+ –(LDH)–> pyruvate + NADH
(2) et dosage de ↑@ 340 nm
Le dosage enzymatique de la lipase pancréatique implique une succession de réactions enzymatiques, laquelle représente le bon ordre:
A- Lipase pancréatique –> glycérol kinase –> monoglycéride lipase –> glycérol phosphate oxydase –> peroxydase.
B- Lipase pancréatique –> monoglycéride lipase –> glycérol kinase –> glycérol phosphate oxydase –> peroxydase.
C- Lipase pancrétatique –> monoglycéride lipase –> glycérol kinase –> peroxydase –> glycérol phosphate oxydase
-B
(1) 1,2-diglycéride –(lipase + colipase)–> 2-monoglycéride
(2) 2-monoglycéride –(monoglycéride lipase)–> glycérol + acide gras libre
(3) Glycérol –(glycérol kinase)–> glycérol-3-phosphate
(4) Glycérol-3 phosphate –(glycérol phosphate oxydase)–> H2O2
(5) H2O2 + 4-AAP + TOOS –(peroxidase)–> quinoneimine (augmente Abs à 550nm)
4-AAP = 4-aminoantipyrene
Décrire une méthode pour le dosage de la lipase pancréatique
Méthode 1:
Un substrat chromogène de la lipase (comme le DGGMR) est clivé par la lipase de l’échantillon –> un produit instable est produit ( acide glutarique ester) –> ce dernier se décompose spontanément en Méthylresorufin détectée par spectrophotométrie (augmente Abs à 580nm)
(1) Triglyceride + glutarate-(6-methylresorufin) ester chain –(lipase+ sels biliaires + colipase)–> 1,2-0-dilauryl-rac-glycerol + glutaric acid-(6-methylresorufin) ester
(2) glutaric acid-(6-methylresorufin) ester –> glutaric acid + methylresorufin
Méthode 2:
Enzymatique Quinoneimine
(1) 1,2-diglycéride –(lipase + colipase)–> 2-monoglycéride
(2) 2-monoglycéride –(monoglycéride lipase)–> glycérol + acide gras libre
(3) Glycérol –(glycérol kinase)–> glycérol-3-phosphate
(4) Glycérol-3 phosphate –(glycérol phosphate oxydase)–> H2O2
(5) H2O2 + 4-AAP + TOOS –(peroxidase)–> quinoneimine (augmente Abs à 550nm)
Décrire une méthode pour le dosage de la GGT
Méthode enzymatique en une seule étape:
- L-γ-glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilide + glycylglycine –(sample GGT)–> γ-glutamyl-glycylglycine + 5-amino-2-nitro-benzoate (ANB)
ANB est aussi appelé 3-Carboxy-4-nitroaniline.
La GGT catalyse le transfert du groupe gamma-glutamyl depuis le substrat (gamma-glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilide) vers la glycylglycine, produisant du 5-amino-2-nitrobenzoate (ANB) qui produit une variation de l’absorbance à 410/480 nm directement proportionnelle à l’activité GGT de l’échantillon.
Nommez 10 analytes couramment dosés par les multianalyseurs via des méthodes colorimétriques (non-enzymatiques).
- Calcium total (Arsenazo III (violet) ou ortho-crésophtlaéine)
- Albumine (Bromocrésol pourpre ou vert
- Créatinine (Acide picrique)
- bilirubine totale (DIAZO + agent dissociant ou vanadate + agent dissociant)
- bilirubine directe (DIAZO ou vanadate)
- Protéine totale (Biruet ; CU2+, pH alcalin)
- Phosphate (Molybdate)
- Magnésium (xylidile)
- Fer (Ferrozine ou Ferrène)
- Fructosamide (Formezan)
- TIBC (ferrozine ou ferrène dans une solution acide)
- Protéines urinaire ou du LCR (rouge de pyrogallol)
De quoi est fait la membrane d’électrode sélective pour
A) les H+ (pH)?
B) K+
C) Na+
A) Verre
B) Valinomycine
C) Résine de PVC (avec ou sans ETH227) ou céramique
Nommer des analytes dosés par :
A) Ampérométrie
B) Potentiométrie
C) Cooximétrie
A) pO2, Glucose, Lactate, Créatinine
B) pH, pCO2, électrolytes (Na+, K+, Cl-)
C) Hémoglobine (et ses formes), bilirubine
Aide mémotechnique pour l’Ampérométrie : CLOG (Créatinine-Lactate-Oxygène-Glucose)
Quel sont les deux types de bromocrésol utilisés pour doser l’albumine sérique et quelles sont les particularités de chacun ?
Bromocrésol vert et pourpre.
Bromocrésol vert:
- Les mesures au bromocrésol vert (BCG) ont tendance à surestimer la concentration d’albumine à de faibles concentrations.
- Généralement moins spécifiques que pourpre pour albumine
Bromocrésol pourpre:
- Le bromocrésol pourpre (BCP) est généralement légèrement plus spécifique pour l’albumine et donne des valeurs plus basses que le BCG, notamment chez les patients atteints de maladies rénales.
- Les méthodes au bromocrésol pourpre donnent de fausses valeurs basses chez les patients atteints de jaunisse en raison de l’interférence de la bilirubine au site de liaison.
Notes générales :
- Les dosages de l’albumine avec des colorants ont tendance à avoir une précision réduite lorsque le profil des protéines sériques est anormal.
- L’immunoturbidimétrie et la néphélométrie offrent une plus grande spécificité et précision pour la mesure de l’albumine, ainsi que des limites de détection plus basses nécessaires pour les échantillons présentant de faibles concentrations d’albumine, tels que l’urine et le liquide céphalorachidien (Microalbulmine).
Décrire la méthode de dosage des protéines totales.
Basée sur la méthode de Biuret, un ion de cuivre se lie aux liens peptidiques (azote) des protéines en milieu alcalin pour donner une solution mauve. Mesure spectrophotométrique à 540nm.
(1) Protéine (nitrogen from 4 amino acid ~liens peptidiques) + Cu2+ –(pH alcalin)–> Complexe cuprique
Quel est la longueur d’onde d’adsorption du NADH?
340 nm
Nommez un chromophore utilisé pour le dosage du calcium total ainsi que la longueur d’onde à laquelle il est mesuré?
1) Arsenazo III => Complexe Ca:Arsenazo III (660 nm)
2) Acide chloranilic => Acide chloranilic (mauve)
Calcéine => Complexe Ca:Calcéine (Fluorescent)
O-Crésolphthaléine => Complexe rouge (520nm)
3) Ca2+ + ortho-cresolphatlein => colored complex (575 nm) (hydroxyquinoline added to prevent Mg2+ interactions; complex formation is dependent on T° and is non-linear – can bound 1 or 2 Ca2+ ion depending on concentration)
*Dépend du pH; calcium total = dissocié de l’albumine en condition acide.
Nommez un chomophore utilisé pour le dosage de la bilirubine?
Sel de Diazonium (bleu-548 nm)
Note: Formé par la réaction de l’acide sulfanilic et nitrite de sodium. Le Diazo est employé dans la méthode de Malloy-Evelyn (Méthanol = Total et direct) et Jendrassik-Grof (Cafféine = Total).
Quel chromophore est utilisé par la méthode de dosage de la créatinine colorimétrique?
Acide picrique ou Picrate (Méthode de Jaffé)
Comment est dosé le Fe2+
Fe2+ + ferrozine (ou ferene sur Abbott) –> Complexe coloré (562/571 nm) en milieu acide pour dissocier le fer de la transferrine (et réduire le Fe3+ en Fe2+).
Comment est dosé le TIBC (mesure indirecte de la transferrine) ?
Transferrine-Fe3+ pH acide => Dissociation Fe3 à la transferrine et Réduction en Fe2+
Exogenous Fe2+-ferrozine + endogenous transferrine => (pH neutre) Fe2+-transferrin and Fe2+-ferrozine
Baisse de la DO à 562/571 nm
Nommer un chromophore utilisé pour doser le Mg2+
1) Calmigite (+EGTA) (530-550 nm)
2) Bleu de méthylthymol (510 et 600 nm)
3) Bleu de xylidyl (600 nm)
4) Jaune de titan (pH alcalin, )
À quoi sert respectivement l’ajout de KCN et du polyvinylpyrrolidone dans les réactions de dosage du Mg2+ ?
KCN => Minimise l’interférence aux métaux lourds (inhibe la formation de complexe)
Polyvinylpyrrolidone => Minimise l’interférence aux protéines
Pour la réaction utilisant la calmagite.
EGTA is used to prevent Ca2+ interference, and KCN is used to inhibit heavy-metal complexes. Polyvinylpyrrolidone and its 9-ethylene oxide adduct (Bion PVP, Bion Ne-9) have been employed to prevent serum proteins from shifting the absorbance maxima of the Mg-calmagite complex [10].
[10] Pierce Magnesium Stat Kit, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; insert revised Feb. 1979.
L’ammonium de molybdate est utilisé dans le dosage de quelle analyse et à pH acide ou basique ?
Phosphate, pH acide
Nommer 5 analytes dont le dosage implique une diminution de l’absorbance à 340 nm (NAD/P+)
Ammoniac
ALT
AST
Bicarbonate
Urée
(créatinine aussi avec la méthode enzymatique utilisant l’hexokinase)
Nommer 4 analytes dont le dosage implique une augmentation de l’absorbance à 340 nm (NAD/PH)
CK
Glucose
Lactate
LDH
Mnémotechnique gracieusité de ChapGPT: “Chaque Kangourou Glandouille, Lambine et Dort.”
Quelle enzyme est utilisé pour le dosage de l’ammoniac (NH3)?
Glutamate déshydrogénase
Quelles enzymes sont utilisés pour le dosage du bicarbonate ?
(1) PEP carboxylase et (2) malate déshydrogénase (dans la même réaction)
Quelles enzymes peuvent être utilisés pour le dosage du glucose ?
1) Hexokinase + G-6-P-DH
2) Glucose oxydase
3) Glucose déshydrogénase (Accu-Chek)
Lors du dosage du glucose avec utilisation de la glucose oxydase, de quelle façon la concentration de glucose peut-elle être mesurée?
- Mesure de l’oxydation de H2O2 = courant électrique proportionnelle (Ampérométrie)
OU - Mesure de la consommation d’oxygène = courant électrique proportionnelle (Ampérométrie)
OU - H2O2 + chromogène + peroxydase = Couleur +H20 (Méthode trinder ; plus sensible aux interférences)
Quelles enzymes peuvent être utilisés pour le dosage du lactate ?
1) Lactate déshydrogénase
2) Lactate oxydase + peroxydase (avec quinoneimine)
Quelles enzymes sont utilisés pour le dosage de l’urée ?
(1) Uréase + (2) glutamate déshydrogénase (même réaction)
La réaction suivante permet de doser quel analyte (un des analytes est représenté comme XYZ dans la réaction pour ne pas donner la réponse) :
α-ketoglutarate + XYZ + NADPH => (glutamate DH) => L-glutamate+ NADP+
Avec ↓@ 340 nm
Ammoniaque
XYZ = NH3
La réaction suivante permet de doser quel analyte (un des analyte est représenté comme XYZ dans la réaction pour ne pas donner la réponse) :
1-) α-ketoglutarate + XYZ => (XYZase de l’échantillon) => pyruvate + L-glutamate
2-) pyruvate + NADH=> (LDH) => lactate + NAD+
Avec↓@ 340 nm
ALT
(XYZ = alanine)
(XYZase de l’échantillon = ALT de l’échantillon)
La réaction suivante permet de doser quel analyte (un des analyte est représenté comme XYZ dans la réaction pour ne pas donner la réponse) :
1-) XYZ + O2 + 2 H2O => XYZase => allantoin + CO2 + H2O2
2-) H2O2 + 4-aminoantipyrene + TOOS (a trinder reagent) => (peroxidase) => quinoneimine
Avec ↑@ 545 nm (ou 604 nm pour Abbott)
Acide urique
(XYZ = acide urique)
(XYZase = uricase)
La réaction suivante permet de doser quel analyte (un des analyte est représenté comme XYZ dans la réaction pour ne pas donner la réponse) :
XYZ + ammonium molybdate (à pH acide) => complexe de phosphomolybdate d’ammonium
Phosphate
(XYZ = phosphate)
Nommez les analyses qui peuvent utiliser le pyruvate comme substrat ou produit dans les réactions de dosages enzymatiques (N=3).
Lactate, LDH et ALT
Également la créatinine avec la méthode enzymatique avec la créatine kinase
Nommez les analyses qui peuvent utiliser le oxaloacetate comme substrat ou produit dans les réactions de dosages enzymatiques (N=2).
AST, HCO3-
Nommez les analyses qui peuvent utiliser le glucose comme substrat ou produit dans les réactions de dosages enzymatiques (N=2)
Glucose, CK et créatinine (dosage enzymatique)
AC: Je ne crois pas que la créatinine enzymatique utilise le glucose.
Nommez les analyses qui peuvent utiliser le glutamate comme substrat ou produit dans les réactions de dosages enzymatiques (N=4).
Ammoniac, ALT, AST, urée,
Nommez les analyses qui peuvent utiliser l’α-ketoglutarate comme substrat ou produit dans les réactions de dosages enzymatiques (N=4).
Ammoniac, ALT, AST, urée
Nommez les analytes qui sont dosés couramment par des méthodes enzymatique utilisant du peroxyde et de la quinoeimine. (N=6)
HDL Cholesterol, LDL Cholesterol, triglycerides, acide urique, lipase (1 des 2 méthodes courantes), Glucose oxydase (1 des 3 méthodes de détections)
Également le lactate lorsque dosé avec la lactate oxydase
Quelle enzyme sérique est mesurée par cette réaction?
- 4-nitrophenol-(glucose)7 => Enzyme de l’échantillon =>
NP-(glucose)4,3,2 + -(glucose)3,4,5 - NP-(glucose)4,3,2 => (α-glucosidase) =>
4 or 3 or 2 (glucose + NP) ↑@ 410 nm
Amylase
Quelle enzyme sérique est mesurée par cette réaction?
L-γ-glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilide + glycylglycine => Enzyme de l’échantillon =>
γ-glutamyl-glycylglycine + 5-amino-2-nitro-benzoate (ANB)
Avec ↑@ 410 nm
Note: L’ANB est aussi appelé 3-Carboxy-4-nitroaniline.
GGT
Quelle enzyme sérique est mesurée par cette réaction?
p-nitrophenyl phosphate => Enzyme de l’échantillon
p-nitrophenoxide + phosphate
Avec ↑@ 410 nm
ALP
Quelle enzyme sérique est mesurée par cette réaction?
1) Triglyceride avec une chaine 1 glutaric acid-(6-methylresorufin) => Enzyme de l’échantillon =>
ester de 1,2-0-dilauryl-rac-glycerol + ester d’acide glutarique-(6-methylresorufin)
2) ester d’acide glutarique-(6-methylresorufin) =>
glutaric acid + methylresorufin
Avec ↑@ 580 nm
Lipase
Quelle enzyme sérique est mesurée par cette réaction?
1) 1,2-diglycéride => Enzyme de l’échantillon =>
2-monoglycéride
2-) 2-monoglycéride => (XYZase) => glycérol + acide gras libre
3-) Glycérol => (glycérol kinase) => glycérol-3-phosphate
4-) Glycérol-3 phosphate => (glycérol phosphate oxydase ) => H2O2
5) H2O2 + 4-aminoantipyrene + TOOS (a trinder reagent) => (peroxidase) quinoneimine
Avec ↑@ 548 nm
Lipase
XYZase = monoglycéride lipase
Vrai ou faux: lors du dosage du HDL, une étape préliminaire où le LDL est éliminé est nécessaire avant le dosage du HDL. Ceci est possible grâce à des surfactant chargé qui protègent les molécules de HDL pendant que les molécules de LDL peuvent réagir.
Faux, c’est l’inverse!
LDL-c + charged surfactant à (cholesterol esterase & oxidase) = NO REACTION
tandis que
HDL-c + charged surfactant à (cholesterol esterase & oxidase) = H2O2 + 7-α-hydroxy-4-c…one
2 H2O2 à (catalase) 2 H2O + O2
Vrai ou faux: lors du dosage du HDL, une étape préliminaire où le LDL est éliminé est nécessaire avant le dosage du HDL. Ceci est possible grâce à du sulfate de cyclodextrin et du MnCl2 qui protègent les molécules de HDL pendant que les molécules de LDL peuvent réagir.
C’est faux!
Il n’y a pas d’étape préliminaire. C’est surtout la présence de PEG d’une certaine longeur qui est lié à la cholestérol estérase et à la cholestérol oxydase qui permet la réaction avec les vésicules lipophilique de la taille des HDL. L’addition du sulfate de cyclodestran permet de réduire d’avantage la réactivité pour les vésicules de plus grandes tailles (LDL, VLDL et chylomicron).
À titre indicatif, la réaction est la suivante:
Étape 1a) HDL-c + cyclodextrin sulfate + MnCl2 => PEG-cholesterol esterase => Cholestérol + Acide gras
Étape 1b) LDL-c + cyclodextrin sulfate + MnCl2 => PEG-cholesterol => PAS DE RÉACTION
Étape 2a) Cholestérol (dans les HDL) + O2 => PEG-cholesterol oxidase => H2O2 + 4-cholesten-3-one
Étape 2b) Cholestérol (dans les LDL ) + O2 => PEG-cholesterol oxidase => PAS DE RÉACTION
Étape 3) H2O2 + 4-aminoantipyrene + phenol (ou bien autre réactif de trinder) => (peroxidase) => teinture de quinoneimine
Les cofacteurs suivants sont utilisés par quelle(s) enzyme(s)?
- Vitamine B6 (aussi appelé pyridoxal phosphate)
- Cation divalent (zinc ou magnésium)
- Sels biliaires
- Mg (spéficiquement)
- La B6 est le cofacteur des transaminases, soit ALT et AST
- ALP
- Lipase pancréatique (ainsi que la colipase)
- Bicarbonate (à cause de la PEP carboxylase), créatine kinase (à noter que l’hexokinase utilisée dans la réaction de dosage du glucose et de la CK utilise le Mg comme cofacteur).
Nommez les cofacteurs et le pH de réaction des enzymes suivantes :
A) Lipase
B) AST
C) ALP
D) PEP carboxylase
E) ALT
F) Amylase
G) Créatinine kinase
H) GGT
I) Hexokinase
A) Lipase: Colipase + Sels biliaires
B) AST : PLP ou P5P, pH alcalin ~ 7.7
C) ALP : Mg2+ et Zn2+, pH alcalin ~9.0-10.5
D) PEP carboxylase : Mg2+
E) ALT : PLP ou P5P, pH neutre ~7.2
F) Amylase : Cl- et Ca2+, pH neutre ~6.9-7.0
G) Créatine kinase : Mg2+, pH acide ~6.7
H) GGT : Aucun, pH alcalin ~7.8-8.5
I) Hexokinase : Mg2+, pH ~7.3-7.4 (physiologique)
Note: Excès de Mg2+ peut être inhibiteur pour la CK.
Vrai ou Faux. À pH acide, la formation d’ATP par la Créatine kinase est favorisé, alors qu’à pH alcalin, celle-ci forme de l’ADP et de la créatine-phosphate.
Vrai
Lequel des analytes suivants n’est pas affecté par l’EDTA?
A) ALP
B) Bicarbonate
C) Créatinine (enzymatique)
D) Créatine kinase
E) Aucune de ces réponses
La réponse peut être C ou E selon la réaction enzymatique de la créatinine utilisée
Exemple : Méthode utilisant la CK sera affecté ;
(1) Créatinine + H2O –(Créatininase)–> Créatine
(2) Créatine + ATP –(CK)–> Créatine-phosphate + ADP
(3) ADP + phosphoenolpyruvate –(Pyruvate kinase)–> ATP + pyruvate
(4) Pyruvate + NADH +H+ –(LD)–> NAD+ + Lactate
Méthode basé sur la Sarcosine oxydase ne sera pas affecté ;
(1) Créatinine + H2O –(Créatininase)–> Créatine
(2) Créatine + H2O –(Créatinase)–> Sarcosine + Urée
(3) Sarcosine + O2 + H2O –(Sarcosine oxydase)–> Formaldéhyde + Glycine + H2O2
(4) Indicateur (réduit) + H2O2 –(peroxydase)–> Indicateur (oxydé) + 2 H2O
