Semaine 12 - Immunoessais Flashcards
Comment peut-on expérimentalement distinguer des anticorps hétérophiles vs des anticorps anti-animaux ?
Ajouter du FC block.
Ajouter aux réactifs des protéines sériques de même source animale que celle des Ab.
Quelle performance les tests de TSH doivent offrir pour être considérés de 3ième génération ?
Ils doivent avoir un CV<20% à une concentration de 0,01 mUI/L.
Quel est le résultat d’une interférence à la biotine sur un immunoessais non-compétitif versus compétitif ?
Lorsque la liaison biotine-streptavidine est utilisée dans le cadre d’un test immunométrique «sandwich», l’excès de biotine dans l’échantillon peut bloquer la liaison des anticorps biotinylés aux sites de liaison de la biotine sur la phase solide recouverte de streptavidine, ce qui entraîne des résultats faussement faibles.
En revanche, pour les dosages immunologiques «compétitifs», un excès de biotine dans l’échantillon peut bloquer la liaison de l’analyte biotinylé aux sites de liaison de la biotine sur la phase solide recouverte de streptavidine, entraînant des résultats faussement élevés.
La biotine peut être utilisé pour l’amplification du signal ou la liaison covalente des anticorps de capture à une surface.
Comment le test compétitif diffère-t-il du test non-compétitif en termes de sensibilité ?
Moins sensible que non-compétitif.
Quel type de molécules est idéal pour le test compétitif ?
Petites molécules.
Comment la liaison à l’anticorps pour l’antigène marqué change-t-elle dans le test compétitif en fonction de la concentration d’antigène non marqué ?
Elle est inversement proportionnelle.
Quel est l’avantage de réaliser le test compétitif en mode séquentiel ?
Amélioration de la limite de détection.
En quel quantité le réactif doit-il être présent en immunoessais compétitif ? Et en non-compétitif ?
- Compétitif : Le réactif est limitant
- Non-compétitif : Le réactif est en excès
Quel avantage technique est associé aux tests en phase homogène dans les immunoessais ?
Ne nécessite pas de séparation de phases (anticorps ou antigène libre et marqué) = réaction de type précipitin, Rapidité et simplicité.
Avec quel type d’anticorps les deux phases de capture d’un essais non-compétitif peuvent être effectuées en une seule étape sans lavage intermédiaire?
Avec des anticorps monoclonaux reconnaissant des épitopes distincts.
Quelles sont les enzymes les plus couramment utilisées comme marqueurs enzymatiques dans les immunoessais ?
Peroxidase de raifort (HRP), phosphatase alcaline, β-galactosidase, glucose-6 phosphate déshydrogénase.
Quelle condition doit être satisfaite pour que les marqueurs enzymatiques génèrent des résultats fiables dans les immunoessais ?
La conjugaison doit générer des conjugués stables sans altérer la réactivité immunologique.
Quels sont les avantages et inconvénient des marquages radioactifs pour les immunoessais ?
Avantages :
- Moins coûteux
- Marquage qui n’affecte pas les propriétés de la molécule marquée
- Meilleure sensibilité analytique que la néphélométrie
- Peu d’effet d’interférence des indices sériques sur le signal.
Désavantages :
- Techniques manuelles
- Requiert une gestion des déchets, un permis, une documentation et la formation du personnel
- Méthode en phase hétérogène
- Surveillance étroite et validation des courbes d’étalonnage, réactifs instables (demi-vie)
- Nécessite compteur gamma.
Décrire le principe du EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique).
Enzymatique en phase homogène – non-compétitif.
L’analyte (drogue) dans l’échantillons compétitionne avec un analyte marqué avec l’enzyme glucose-6-phosphate déshydrogénase (ou Malate déshydrogénase, Lysozyme). La liaison AC-Analyte analogue+G6P empêche l’activité de l’enzyme G6P. Si présence d’analyte dans l’échantillon, prend la place de l’analyte analogue+G6P qui est libre et qui peut lier son substrat (NAD) et généré un produit (NADH) qui peut être lue par absorbance (340nm). Si faible concentration dans l’échantillon : peu d’activité. Concentration élevée : plus d’activité (neutralise certains réactifs ab et laisse plus d’enzymes libres de réagir avec le substrat). Relation linéaire entre la concentration du médicament et l’activité mesurée. Lecture par spectrophotométrie. Limité aux petites molécules (médicaments, stéroides, vitamines).
Décrire le principe CEDIA (Cloned enzyme donor immunoassay)
Enzymatique en phase homogène – non compétitif.
Une enzyme (comme la bêta-galactosidase) est génétiquement modifiée en deux fragments inactifs : un petit fragment appelé donneur d’enzyme (ED) conjugué à l’analogue de l’analyte, et un plus grand fragment accepteur d’enzyme (EA) : lorsque les deux fragments s’associent, l’enzyme complète convertit un substrat en un produit coloré. Si des molécules d’analyte sont présentes dans l’échantillon, elles entreront en compétition avec fragment ED congugé en solution pour les sites d’AC, de sorte que l’analogue marqué ED libre pourra se lier à l’EA et générer un signal colorimétrique directement proportionnel à la quantité d’analyte.
Décrire le principe de FRET (Fluorescence resonance energy transfer)
Fluorimétrique non-compétitif de type sandwich.
Processus de transfert d’énergie entre deux fluorophores, le donneur et l’accepteur, sans émission de photon. Ce transfert d’énergie se produit lorsque les fluorophores sont à une distance proche, généralement de 1 à 10 nanomètres, et que leurs propriétés spectrales permettent cette interaction. Un anticorps cible est conjugué à un fluorophore donneur tandis qu’un autre fluorophore agit en tant qu’accepteur. Lorsque l’anticorps cible se lie à l’antigène dans l’échantillon, les fluorophores se rapprochent, induisant le transfert d’énergie par FRET. Cela résulte en un signal de fluorescence spécifique, habituellement une augmentation de l’intensité de fluorescence de l’accepteur, qui est proportionnelle à la quantité d’antigène présent.
Décrire le principe de FPIA (fluorescence polarization immunoassay)
Fluorométrique compétitive en phase homogène. L’analyte (drogue) dans l’échantillons compétitionne avec un analyte marqué avec un fluorescent. Utilise le principe de polarisation de la fluorescence pour faire la distinction entre les complexes immunologiques (lumière reste polarisée) et le marqueur libre (lumière dépolarisée). Si pas présence d’analyte dans l’échantillon, plus de molécule fluorescente sont lié aux AC. Cette liaison ralentie la vitesse de rotation brownienne des molécules fluorescente et produite une plus grande fluorescence polarisée. Inversement, si bcp d’analyte, une plus grande qté de molécules fluo sont libre et celles-ci rotationnent vite est produise peu de fluorescence polarisée. Si faible concentration dans l’échantillon : + polarisé. Concentration élevée : - polarisé. Ou polarisation P = (Iv - Ih ) / (Iv + Ih), Iv = intensité lumière émise plan vertical et Ih = intensité lumière émise plan horizontal. Relation inversement proportionnelle entre la concentration de l’analyte et l’activité mesurée. *Commercialisé par Abbott, était coûteux et n’est plus disponible
Décrire le principe de TRACE/Kryptor (Thermo, Time Resolved Amplified Cryptate Emission)
Fluorimétrique non compétitif de type sandwich. Anticorps marqué avec un chélat d’Europium (donneur) et second anticorps marqué avec allophycocyanine (accepteur). Une fois le complexe sandwich formé par la liaison avec l’antigène, une lumière incidente de 337 nm est irradiée : un transfert d’énergie a lieu entre le donneur et l’accepteur. En absence de complexe immun, la fluorescence de l’accepteur est de très courte durée (nanosecondes). En présence de complexe immun, le transfert d’énergie de l’Europium permet d’allonger considérablement le temps d’émission de fluorescence de l’accepteur à 665 nm.
Décrire le principe de KIMS (Roche, Kinetic interaction of microparticle in solution)/PETINIA (Siemens)
Turbidimétrique compétitif en phase homogène. En l’absence de l’analyte, les anticorps libres se lient aux conjugués de microparticules d’analyte pour former des agrégats qui absorbent dans la gamme visible. L’absorbance (ou la turbidimétrie) est monitorée et en présence de l’analyte, l’Ab se lie à l’analyte libre empêchant l’agrégation des microparticules ; une diminution de l’absorbance est observée (le signal est inversement proportionnel à la concentration de l’analyte).
Décrire le principe d’ECLIA (Roche, Electrochemiluminescent immunoassay).
Basée sur le changement du signal d’électrochimioluminescence (ECL) du ruthénium avant et après l’immunoréaction. Le ruthénium subit une réaction électrochemiluminescente à 620 nm avec le tripropylamine (TPrA) à la surface d’une électrode. Ce marqueur sert dans les immunoessais avec couplage sur billes magnétiques. Billes captées par aimant à la surface de l’électrode. Utilisation d’un dérivé d’antigène marqué au ruthénium. Compétition pour l’anticorps avec l’antigène non marqué. Isolation des complexes grâce aux microparticules magnétiques. Existe aussi en version sandwich (non compétitif).
Décrire le principe de LOCI (Luminescent oxygen channeling immunoassay)
Chemiluminescence de type sandwich (non compétitif) en phase homogène. Le mélange réactionnel est irradié pour générer des O- dans des microbilles couplées à l’analyte (excitative/sensitizer). Ne réagissent pas avec la particule émettant la chemiluminescence sauf si elle est en complexe et donc à distance très rapprochée. Lorsqu’il est lié à la molécule d’AC-biotine respective, également couplée à un autre type de bille-streptavidine (émettant/chemiluminescer), l’analyte réagit avec l’oxygène et des signaux de chimioluminescence sont générés proportionnellement à la concentration du complexe analyte-Ab.
Permet la détection de grosses molécules.
Quelle est la différence entre les anticorps hétérophiles et les anticorps anti-animaux ?
Les anticorps hétérophiles sont de faible affinité et poly-spécifiques, tandis que les anticorps anti-animaux sont monospécifiques de forte affinité contre des épitopes d’animaux spécifiques.
Qu’est-ce que l’effet crochet?
Un excès d’antigène diminue le signal puisque les anticorps sont saturés.
Quel est l’impact de la présence de biotine exogène sur un dosage par méthode ECLIA Roche ?
La biotine bloque les sites streptavidines des billes aimantées. Empèche la liaison des anticorps ou des antigènes liés à la biotine.
Si méthode compétitive = lavage des AC/AG marqué et non-marqué = baisse du signal = inversement proportionnelle = fausse élévation de la concentration.
Si méthode sandwich = lavage des AC/AG marqué et non-marqué = baisse du signal = directement proportionnelle = fausse diminution de la concentration.
Décrire un procédé d’investigation des interférences
- Test de dilution
- Test de précipitation
- Comparaison avec une autre méthode
- Ajout d’agents bloquants
Décrire l’impact d’anticorps interférents sur les méthodes compétitives vs non-compétitives
Décrire l’impact d’anticorps interférents sur les méthodes non-compétitives
Qu’est-ce qu’un test d’Ouchterlony?
Méthode sur gel (agar ou agarose)
Double diffusion: 2 antigènes et 1 anticorps
Chaque réactif va diffuser selon sa concentration
La rencontre des fronts de migration des deux réactifs permet la formation de complexes immuns
En zone d’équivalence il y aura précipitation qui sera visible à l’oeil nu
Temps requis long : 48-72h
Permet de savoir si 2 antigènes sont identiques, cross réactifs ou non identiques
A) Lorsque le même antigène est dans des puits adjacents : réaction d’identité. Fusion des lignes de précipitation
B) Si les deux antigènes sont différents : lignes croisées
C) Si les eux antigènes sont similaires mais non identiques, on observe une
réaction d’identité partielle
Limites : si absence de précipitation, peut signifier absence de l’antigène, trop
faible concentration pour être détectée, anticorps non précipitant ou encore un excès d’antigène.
Comment se disperse la lumière lorsqu’elle rencontre une molécule
1. < lambda/10
2. lambda/10 à lambda
3.»_space; lambda
- Dispersion de Rayleigh : dispersion = à l’arrière et à l’avant, un peu plus faible à 90
Les rayons lumineux dispersés sont alors en phase et se renforcent
Ex: protéines plasmatiques - Molécules un peu plus grosses : dispersion avant plus importante Beaucoup moindre à 90
Ex: IgM, chylomicrons, complexes Ag-Ac - Asymétrie et différence angulaire
Très utile pour caractériser et différencier des classes de cellules et macromolécules
Les rayons lumineux dispersés ne sont plus tous en phase il y a du renforcement dans certaines directions et des interférences destructives dans d’autres
Ex: GR, bactéries
