Semaine 3_Spectrophotométrie

Question 1

Quel est la longueur d’onde d’adsorption du NADH?

Answer 1

340 nm

Question 2

Décrire la méthode de dosage des protéines totales.

Answer 2

Basée sur la méthode de Biuret, un ion de cuivre se lie aux liens peptidiques (azote) des protéines en milieu alcalin pour donner une solution mauve. Mesure spectrophotométrique à 540nm.

Question 3

Quelle est la loi de Beer-Lambert?

Answer 3

A=εbc ou A = absorbance, ε = coefficient d’absorption moléculaire, b = chemin optique et c = concentration.

Aussi,

A = -log(T) ou T = transmittance.

Question 4

Quels sont les patrons d’absorbance des indices HIL ?

Answer 4

H: 415, 540, 560
I: 420-460 et 550-600
L: 340, 600

Question 5

Nommez un chromophore utilisé pour le dosage du calcium total ainsi que la longueur d’onde à laquelle il est mesuré?

Answer 5

1) Arsenazo III => Complexe Ca:Arsenazo III (660 nm)

2) Acide chloranilic => Acide chloranilic (mauve)
Calcéine => Complexe Ca:Calcéine (Fluorescent)
O-Crésolphthaléine => Complexe rouge (520nm)

3) Ca2+ + ortho-cresolphatlein => colored complex (575 nm) (hydroxyquinoline added to prevent Mg2+ interactions; complex formation is dependent on T° and is non-linear – can bound 1 or 2 Ca2+ ion depending on concentration)

*Dépend du pH; calcium total = dissocié de l’albumine en condition acide.

Question 6

Quel sont les deux types de bromocrésol utilisés pour doser l’albumine sérique et quelles sont les particularités de chacun ?

Answer 6

Bromocrésol vert et pourpre.

Les mesures au bromocrésol vert (BCG) ont tendance à surestimer la concentration d’albumine à de faibles concentrations et les méthodes au bromocrésol pourpre donnent de fausses valeurs basses chez les patients atteints de jaunisse en raison de l’interférence de la bilirubine au site de liaison.
Le bromocrésol pourpre (BCP) est généralement légèrement plus spécifique pour l’albumine et donne des valeurs plus basses que le BCG, notamment chez les patients atteints de maladies rénales.

Les dosages de l’albumine avec des colorants ont tendance à avoir une précision réduite lorsque le profil des protéines sériques est anormal. L’immunoturbidimétrie et la néphélométrie offrent une plus grande spécificité et précision pour la mesure de l’albumine, ainsi que des limites de détection plus basses nécessaires pour les échantillons présentant de faibles concentrations d’albumine, tels que l’urine et le liquide céphalorachidien (Microalbulmine).

Question 7

Dans un appareil de spectrophotométrie, qu’est-il mesuré, l’absorbance ou la transmittance ?

Answer 7

La transmittance est le paramètre directement mesuré, tandis que l’absorbance correspondante est calculée selon la formule A= -log(T).

Question 8

Quel est la relation entre l’absorbance et la concentration, lorsque la loi de Beer-Lambert s’applique ?

Answer 8

Linéaire

Question 9

Quels facteurs peuvent affecter le coefficient d’absorption moléculaire (ε).

Answer 9

Peut être affectée par la température, le pH et la matrice de la solution contenant le chromogène (force ionique)

Question 10

À quoi correspond le coefficient d’absorption moléculaire (ε) ?

Answer 10

Il s’agit de la quantité de lumière absorbée pour une concentration de 1 mol/L d’un chromogène, à une longueur d’onde spécifiée, avec une longueur de trajet de cuvette de 1 cm.

Question 11

Quelle est la plage de mesure optimale pour la plupart des spectrophotomètres ?

Answer 11

La plage de mesure optimale pour la plupart des spectrophotomètres est entre 0 et 1.0A. Au-delà de cette valeur, il y a une diminution progressive de la précision et de l’exactitude des mesures.

Question 12

Décrire en ordre les composantes d’un spectrophotomètre

Answer 12

1. Source de lumière
2. Isolation de la λ (fente, monochromateur, fente). Le monochromateur peut être l’une des 3 composantes suivantes :
   Filtre, Prisme (sépare par refraction),
   Grillage de diffraction (chaque ligne génère un petit spectre, celle en phase sont renforce)
3. Fibre optique
4. Cuvette
5. Photodétecteur: converti la lumière en signal électrique
   - Photodiode: photodétecteur solide fabriqué avec un semi-conducteur photosensible (rapide, $, plrs λ d’analyse)
   - Photodétecteur sensible aux effets de la lumière parasite (+ sensible)
   - Photomultiplicateur: amplifie le signal d’un photon 107 qui seront détectés à l’anode
6. Détecteur
7. Enregistreur de donnée
8. Transfert à l’ordinateur

Question 13

Comment amoindrir les intérférences en spectrométrie ? (HIL)

Answer 13

• Facteur de correction
• Lecture à 2 λ

Question 14

Quel chromophore utilise la méthode de dosage de la créatinine?

Answer 14

Acide picrique ou Picrate (Méthode de Jaffé)

Question 15

Nommez un chomophore utilisé pour le dosage de la bilirubine?

Answer 15

Sel de Diazonium (bleu)

Note: Formé par la réaction de l’acide sulfanilic et nitrite de sodium. Le Diazo est employé dans la méthode de Malloy-Evelyn (Méthanol = Total et direct) et Jendrassik-Grof (Cafféine = Total).

Question 16

Quels sont les avantages et incovénients des calibrations en 2 points ou multipoints pour la spectro ?

Answer 16

2-points :
(+) Moins de consommable utilisé, calibration plus rapide
(-) CVa un peu moins bon

Multi-points :
(+) CVa plus petit
(-) plus lent, utilisation de plus de consommable

Question 17

Schématiser un spectrophotomètre à double faisceau dans l’espace (pour soustraction d’une l’ongeur d’onde contaminante)

Answer 17

Question 18

Dessiner le schéma d’un spectrophotomètre de double faisceau dans le temps (pour la soustraction d’un blanc en simultané).

Answer 18

Question 19

Quels sont les limitations de la fluorescence ?

Answer 19

• Dérivé de Beer-Lambert, si Absorption de la solution augmente; relation > non-linéaire (Effet de filtre intérieur)
• Quencing de concentration: échange à + faible É d’un fluorophore causant une fluorescence + faible qu’attendu
• Dispersion de la lumière
• Effet de la cuvette et du solvent
• Effet de matrice: échantillon qui contient des molecules fluorescence (ex. Fluorescein, NAD+
• Sensible au changement de T° (1-5% de fluorescence / ° de T)
• Photodécomposition: excitation de solutions faiblement fluorescentes ou diluée avec des sources de lumière intense cause un photobleaching (perte de fluorescence)

Question 20

Discutez des principes de néphélométrie et de turbidimétrie, ainsi que de leurs avantages l’un par rapport à l’autre.

Answer 20

Principe:
La néphélométrie et la turbidimétrie sont deux méthodes spectrophotométrique conforme au loi de Beer-Lambert mesurant la formation de complexe insoluble (Ex. Ag-Ac).

La néphélométrie est une méthode directe de mesure de la lumière dispersée par les particules en suspension, perpendiculairement (ou en angle) au faisceau.

La turbidimétrie est la mesure de la lumière transmise par des particules en suspension, qui diminue avec l’augmentation de la quantité de précipité. Elle exige habituellement des concentrations relativement élevées.

Avantages:

La néphélométrie offre une SENSIBILITÉ ANALYTIQUE plus élevée que la turbidimétrie, puisqu’en mesurant la lumière dispersée celle-ci a moins de lumière contaminante.
Un néphélomètre est toutefois plus complexe et plus dispendieux comparativement à un turbidimètre. Il y a également peu d’analyseur automatisé équipé de néphélomètre sur le marché.

Question 21

Quels facteurs intrinsèques à l’appareil peut affecter négativement l’exactitude de mesure d’un spectro (N-3) ?

Answer 21

1. Largeur de la bande passante: Plus elle est large plus l’absorbance est faussement diminué.
2. Lumière contaminante (parasite): peut entraîner des erreurs de mesure, des interférences négatives ou une diminution de la précision des résultats.
3. Inextactitude de la longueur d’onde: modifie les données d’absorbance.

Question 22

Qu’est-ce que la lumière parasite?

Answer 22

Il s’agit de la lumière contaminante, soit de la radiation λ à l’extérieur de la bande étroite de dispersion et de diffraction.

Question 23

Décrivez le principe de la spectrométrie d’émission de flamme (Absorption atomique). Vous pouvez vous aider d’un schéma.

Discutez des avantages et des inconvénients de cette méthode.

Answer 23

La spectrométrie d’émission de flamme est la méthode de références pour certains métaux. Le principe est basé sur l’émission de longueur d’onde précise par un élément métalique lorsque celui-ci obtiens suffisamment d’énergie (Ex. Li = rouge, Na = jaune, K = violet,….). L’énergie dans ce système est fourni par une flamme qui émet une lumière qui sera détecteur par un système composé de fente, monochromateur et d’un détecteur afin de sélectionner la longueur d’onde spécifique d’intérêt.

Avantage:
- Analyse de certains éléments avec moins d’interférence que par d’autre méthode

Inconvénients:
- Analyse des alcalins
- Très dispendieux $$$$
- Conditions strictes et constantes nécessaires à la mesure adéquate

Question 24

Quels sont les pré-requis d’un spectrophotomère idéal?

Answer 24

• Absence de lumière contaminante
• Absence de signal lorsqu’il y a une absence de molécules d’intérêt (Spécificité)
• Mesure de concentration faible de l’analyte d’intérêt
• Absorption et réflexion minimale du système

Question 25

Qu’est-ce que la bioluminescence?

Answer 25

Il s’agit de l’excitation causée par une réaction biochimique qui produit un luminescence et est généralement retrouvé dans un système biologique. Une enzyme (Ex. luciférase) ou photoprotéine (Ex. aequorine) produit une réaction luminescente.

Question 26

Qu’est-ce que la chimiluminescence?

Answer 26

Une chimiluminescence se produit lorsqu’une réaction chimique excite un composé organique qui devient de haute énergie, puis qui émet une longueur d’onde donné lorsqu’il retrouve son état d’origine.
Il s’agit souvent de réaction d’oxydation et nécessite parfois un catalyseur pour permettre la réaction.

Avantages: Sensible, Intervalle dynamique large

Inconvénients: Fuite de lumière, réactif peuvent avoir un background

Question 27

Quels sont les avantages et les inconvénients du mesure par électrochimiluminescence?

Answer 27

L’électrochimiluminescence est basé sur une réaction d’oxydo-réduction et utilise généralement des composés tels que le Ruthénium.

Avantages:
- Réactif stable
- Simple
- Sensibilité augmentée par rapport à la chimiluminescence

Inconvénient:
- Risque de fuite de lumière
- Réactif peuvent avoir un background
- (Sensibilité à la biotine dans des test d’immunoessai avec système streptavidine-biotine)

Question 28

Décrivez le principe de photométrie par réflectance.
Nommez un exemple de son application, ainsi que les avantages et les inconvénients de cette méthode de détection.

Answer 28

La lumière émise par la source est d’abord polarisé à l’aide de filtre, puis réfléchie par l’échantillon. La lumière réfléchie passe à travers un système de monochromateur avant d’être détecter.
La réflectance est évaluée par rapport un ‘blanc’, soit la réflexion de la lumière sur une surface de référence.

La photométrie par réflectance est notamment employée dans les système de chimie sèche ou encore les bandelettes urinaires (lecteur automatique).

Il s’agit d’une méthode simple, rapide et peu coûteuse.
Toutefois, elle est peu précise et l’intensité du signal est souvant non-linéaire.

Question 29

Quel est la longueur d’onde d’adsorption du NADH?

Answer 29

340 nm

Question 30

Nommer 3 exemples de réaction de dosage avec un chromogène

Answer 30

Créatinine + picrate (520 nm)
Albumine + vert de Bromocrésol (628 nm)
Protéine total + cuivre (biuret) (540 nm)à
Cholestérol oxydé + 4-AAP + phénol (500 nm)

Question 31

Dans quel type de détecteur y a t’il amplification du signal?

A) Photodétecteur
B) Photodiode

Answer 31

A

Question 31

Définir le principe de calibration en 2 points

Answer 31

Principe de la Calibration en Deux Points dans un Essai Spectrophotométrique

La calibration en deux points est une méthode couramment utilisée en spectrophotométrie pour établir une relation linéaire entre l’absorbance mesurée et la concentration d’un analyte. Voici les étapes détaillées du processus :

1. Préparation des Standards

-Standard 1 (Point de Blanc):
- Préparer une solution de référence, qui ne contient pas l’analyte à mesurer (concentration = 0).
- Cette solution est souvent appelée “blanc” ou “zéro” et est utilisée pour corriger l’absorbance de base du solvant ou des réactifs.

Standard 2 (Point de Calibration) :
- Préparer une solution contenant une concentration connue et fixe de l’analyte.
- Cette solution sert de point de référence pour établir la relation entre la concentration et l’absorbance.

2. Mesure de l’Absorbance

-Mesure du Blanc :
- Mesurer l’absorbance de la solution de référence (standard 1) à la longueur d’onde spécifique à l’analyte.
- Cette valeur d’absorbance représente le bruit de fond et est notée A0.

• Mesure du Standard de Calibration :
  
  • Mesurer l’absorbance de la solution de concentration connue (standard 2) à la même longueur d’onde.
  • Cette valeur d’absorbance, notée Ac, inclut l’absorbance due à l’analyte et le bruit de fond.

3. Calcul de la Relation Linéaire

• Correction de l’Absorbance :
  
  • Corriger l’absorbance mesurée pour le standard de calibration en soustrayant l’absorbance du blanc :Acorrigée = Ac - A0
  • Cette correction permet d’éliminer les interférences dues aux réactifs ou au solvant.
• Établissement de la Droite de Calibration :
  
  • Utiliser la concentration connue du standard de calibration (Cc) pour établir une relation linéaire entre l’absorbance corrigée et la concentration :

Acorrigée/Cc= k

• Où k est le coefficient de proportionnalité (ou le coefficient d’extinction molaire, si applicable).

4. Mesure des Échantillons Inconnus

• Mesure des Absorbances des Échantillons :
  
  • Mesurer l’absorbance des échantillons inconnus à la même longueur d’onde.
  • Corriger chaque mesure d’absorbance en soustrayant l’absorbance du blanc (A0) :A échantillon corrigée= A échantillon - A0

-Calcul des Concentrations :
- Utiliser la relation linéaire établie pour calculer la concentration des échantillons :

C échantillon= A échantillon corrigée/k

• Cette équation permet de déterminer la concentration des échantillons inconnus en fonction de leur absorbance corrigée.

Avantages et Précautions

• Simplicité et Rapidité: La calibration en deux points est simple et rapide à mettre en œuvre, idéale pour les essais où une linéarité est attendue sur une plage de concentrations limitée.
• Précision : Assure une correction des variations instrumentales et des interférences du solvant/réactif.
• Précautions : La précision dépend de la qualité des standards et de l’exactitude des mesures d’absorbance. Il est crucial de bien préparer les solutions de calibration et d’effectuer les mesures dans des conditions contrôlées.

Cette méthode est largement utilisée en biochimie et en chimie analytique pour des analyses quantitatives précises et fiables.