Semaine 2_Méthode enzymatique Flashcards
Afin de mesurer l’ammoniaque dans les échantillons sériques, la chimie la plus fréquente utilise le système de détection suivant :
A) L’utilisation de la glutamate déshydrogénase qui oxyde le NAD+ en NADH, occasionnant une augmentation de l’absorbance à 340 nm.
B) L’utilisation de la glutamate déshydrogénase qui réduit le NADH en NAD+, occasionnant une diminution de l’absorbance à 340 nm.
C) L’utilisation de la glutamate déshydrogénase qui réduit le NAD+ en NADH, occasionnant une augmentation de l’absorbance à 340 nm.
D) L’utilisation de la glutamate déshydrogénase qui oxyde le NADH en NAD+, occasionnant une diminution de l’absorbance à 340 nm.
D) L’utilisation de la glutamate déshydrogénase qui oxyde le NADH en NAD+, occasionnant une diminution de l’absorbance à 340 nm.
Quel est le cofacteur des aminotransférases?
A) Pyridoxal 5′-phosphate
B) Vitamine B9
C) Quinoneimine
D) Un sel de diazonium
A (autre nom de la vitamine B6)
Vrai ou faux, la méthode suivante représente la méthode de dosage enzymatique de la créatinine:
1-) créatinine + H2O => (créatininase) => créatine
2-) créatine + H2O => (créatinase) => sarcosine + urée
3-) sarcosine + O2 + H2O => (sarcosine oxydase) => formaldéhyde + glycine + H2O2
4-) Indicateur réduit + H2O2 => (peroxydase) => indicateur oxydé + 2 H2O
Vrai
Vrai ou faux, il existe une méthode enzymatique de dosage du magnésium.
Faux
La PEP carboxylase (Phosphoenol pyruvate carboxylase) est une enzyme utilisé dans le dosage de quel analyte?
A) Créatinine (méthode enzymatique)
B) Lactate
C) Urate
D) Bicarbonate
E) Cholestérol
F) Triglycéride
D
Lors du dosage de plusieurs enzymes sériques, tels que ALP et GGT, la réaction est calibrée avec :
A) De l’eau ou du diluant
B) 1 calibrateur contenant une certaine concentration d’enzyme
c) 4 à 6 calibrateurs contenant une série de concentration croissante d’enzyme.
D) Aucun calibration n’est nécessaire, il n’y a que des facteurs intégré à bord des appareils qui sont requis.
A
L’uricase est l’enzyme permettant le dosage de quel analyte?
A) Urée
B) Ammoniaque
C) Urate (Acide urique)
D) Homocystéine
C
Plusieurs réactions enzymatiques utilisent la glutamate déshydrogénase, lesquelles?
Urée, Ammoniaque
Nommer 5 analytes pouvant être dosés par une méthode enzymatique utilisant le NADPH/NADP+/NADH/NAD+
Ammoniaque, ALT, AST, Bicarbonate, CK, Glucose, Lactate, Lactate déshydrogénase, Urée
Nommer 3 analytes pouvant être dosés par une méthode enzymatique utilisant la peroxydase.
Lipase, Acide urique, Triglycéride, LDL-cholestérol, HDL-cholestérol
1-) Nommer les enzymes utilisées en cliniques qui possèdent des isoenzymes.
2-) Nommer les isoenzymes pour chacunes d’entre-elles.
CK (CK-MM, CK-MB and CK-BB)
LD (LD-1, LD-2, LD-3, LD-4, LD-5)
Amylase (surtout: pancréatique et salivaire; dans une moindre mesure: utérine/trompe de faloppe)
ALP (Os : Osseuse. H1: hépatique, H2 : Biliaire. I1 et I2 et I3 : Intestinal. P1 et P2 : Placentaire)
Quels sont les méthodes principales de détection des macroenzymes?
Il y en a 2 principales:
1-) Électrophorèse des isoenzymes
2-) Précipitation de la macro enzyme au PEG 20%
Il est également possible de mesurer un clairance urinaire pour l’amylase dans les cas de suspicions de macro-amylase (puisqu’elle est mesurable dans l’urine et le sérum).
Décrire les réactions enzymatique d’ordre zéro et d’ordre 1.
Ordre 0 : Lors d’excès de substrat, le sens de la réaction est favorisé vers le complexe ES jusqu’à saturation de l’enzyme, où V0 = Vmax, [S] > Km ([S] = 10 à 100 x Km).
Ordre 1 : Lorsqu’il y a une concentration fixe d’enzyme et une variation de substrat, seulement une fraction de l’enzyme forme des complexes avec le substrat, où V0 = (Vmax / Km)* [S], [S] < Km ([S] = ~1/5 Km).
La première étape des dosages enzymatiques de la plupart des analystes (glucose, etc.) est d’ordre 1. Lors des réactions à multiple étape, les autres étapes sont souvent d’ordre 0.
Que sont les réactions enzymatiques bi-substrat?
Certaines enzymes (Ex. Déhydrogénase, Aminotransférase) catalysent des réactions ayant 2 substrats et plus. Les réactions peuvent alors être modulées par la concentration de l’ensemble des substrats. Il existe 2 scénarios possibles pour les enzymes à bi-substrat :
1-) Formation de complexe ternaire enzyme-substrat : ES1, ES1S2, ES2
2-) Relâche du produit avant la liaison du second substrat : Réaction de type Ping-Pong bi-bi.
Est-ce que cet énoncé est vrai ou faux?
Lors de réactions consécutives, la première réaction de méthode enzymatique doit être la réaction limitante, afin que la réaction secondaire ou indicatrice soit directement proportionnelle au taux de formation du produit de la première réaction.
Vrai
Est-ce que cet énoncé est vrai ou faux?
Lors de réactions consécutives, la réaction devient essentiellement irréversible lorsque le produit de la réaction est enlevé/convertit aussitôt que celui-ci est formé.
Vrai
Quels sont les avantages et les inconvénient des méthodes de détections à point final (vs. détection cinétique)?
Avantages:
1-) design simple.
2-) Réaction robuste qui est insensible aux changements mineurs.
Désavantages:
1-) Plus long
2-) Sujet aux interférence intrinsèque à l’échantillon (Enzyme ↑↑↑, Complexation ou Réaction avec substrat ou produit)
3-) Correction requise pour le blanc de réaction
Quels sont les avantages et les inconvénient des méthodes de détection cinétique (vs. détection à point final)?
Avantages:
1-) Rapide
2-) Plus précis
3-) Correction non requise (blanc ou réactif)
4-) Analyse simultanée de plusieurs échantillons
Désavantages:
1-) Plus coûteux $$$
Plus analytiquement demandant (Instruments doivent être précis)
2-) Sensible aux facteurs affectant la vitesse de réaction ([Enzyme], pH, Température)
Nommer, puis décrire brièvement, 2 méthodes de dosage des isoenzymes.
1-) Électrophorèse des isoenzyme sur gel. Séparation des isoenzyme selon leur charge sur un gel d’agarose, puis coloration grâce à l’activité enzymatique via un substrat spécifique à l’enzyme.
2-) Mesure de l’enzyme «mass» au lieu de l’activité enzymatique. Utilisation d’anticorps pour détecter un isoenzyme spécifique (ex: CK-MB, ALP osseuse, amylase salivaire, etc.).
Nommer trois méthodes immunologiques qui utilisent également un principe enzymatique pour la détection de l’analyte. Nommer une enzymes souvent utilisés dans ses dosages.
1-) ELISA: Enzyme-Linked, ImmunoSorbent, Assay. Enzyme souvent utilisée: Peroxydase
2-) EMIT: Enzyme Multiplied Immunoassay Technique. Enzyme souvent utilisée: G6PD et malate DH.
3-) CEDIA: Cloned Enzyme Donor ImmunoAssay. Enzyme TOUJOURS utilisée: β-galactosidase.
Nommer deux types de méthodes utilisées par des EBMD qui utilisent des enzymes immobilisées sur des surfaces/membranes afin de doser des analytes.
1-) Ampérométrie (ex: glucose, lactate, créatinine, etc.)
2-) Potentiométrie (ex: urée, etc.)
Nommer des sources d’interférences des dosages par méthodes enzymatiques
1-) pH de l’échantillon (la majorité des enzymes ont des pH optimaux entre 7 et 8. Exception ALP pH optimal 9-10).
2-) Température (dénaturation à température élevée et inhibition à température basse)
3-) Cycle de gel-dégel (échantillon post-congélation nécessite habituellement 18-24hrs de délai pour s’assurer de sa réactivation totale d’enzyme)
4-) Agents chimiques (urée, détergents (Perturbe les liens hydrogène et les interactions hydrophobes), molécules causant des inhibitions compétitive, non-compétitive, incompétitive.
5-) Concentration insuffisante de coenzyme (vit D6, Ca2+, Mg2+, etc.)
Décrire brièvement les inhibitions enzymatique compétitives, non-compétitive, incompétitive.
Compétitive: Analogue structural compétitionnant avec le
substrat pour la liaison du site actif de l’enzyme libre.
Non-compétitive: Inhibiteur structurellement différent liant un
autre site actif de l’enzyme libre.
Incompétitive : Combinaison d’inhibiteur avec le complexe ES
(+ commun aux réactions bi-substrat).
Définir ce qu’est la cinétique enzymatique?
la vitesse ou la vélocité à laquelle l’enzyme catalyse sa réaction biochimique. Elle est décrite notamment par l’équation de Michaelis-Menten ainsi que la transformation de Lineweaver-Burk (1/v vs 1/[S)]
Définir le postulat de Michaelis-Menten
Le postulat de Michaelis-Menten assume que l’équilibre est atteint rapidement entre l’enzyme (E) +substrat (S) et la formation du complexe ES. La vitesse de réaction est alors proportionnelle à [ES] sous conditions constantes.
Vc = (Vmax [S]) / ( Km + [S] )
Quel(s) facteur(s) influence la Vmax d’une réaction enzymatique?
La Vmax dépend du nombre/quantité d’enzyme pouvant catalysée la réaction.
Elle est ainsi influencé par l’expression de l’enzyme ou la présence d’inhibiteur non-compétitif (l’augmente).
Quel(s) facteur(s) influence la constante de Michaelis de réaction (Km)?
Le Km est définit comme étant également à ½ Vmax. Cette constante dépend de l’affinité de l’enzyme à son substrat (formation de complexe ES et de Produit). Elle est ainsi influencé par la présence d’activateur augmentant l’affinité (diminue Km) ou d’inhibiteur compétitif (augmente Km).
Sur le graphique de Lineweaver-Burk suivant identifier les différents types d’inhibiteurs enzymatiques (Compétitif, Non-compétitif et Incompétitif).
A) Compétitif
B) Incompétitif
C) Non-compétitif
Sur le graphique de Lineweaver-Burk suivant, nommer les différents éléments identifiés.
Définir la formule décrivant ce graphique basé sur l’équation de Michaelis-Menten.
A) 1/v : Inverse de la vélocité ou vitesse
B) 1/Vmax
Si 1/[S] = 0, 1/v=?
1/v = (Km) / (Vmax * [S]) + 1 / Vmax
1/v = (Km/Vmax1/[S]) + 1 / Vmax
1/v = (Km/Vmax0) + 1 / Vmax
1/v = (0) + 1 / Vmax
1/v = 1 / Vmax
C) -1/Km
Si 1/v = 0, 1/[S] =?
1/v = (Km) / (Vmax * [S]) + 1 / Vmax
0 - 1/Vmax = (Km) / (Vmax * [S])
-1/Vmax = (Km / Vmax) * (1/[S])
-1/Vmax(Vmax / Km) = (Km / Vmax)(1/[S])*(Vmax / Km)
-1/Km = (1/[S])
1/[S] = -1/Km
D) 1/[S] : Inverse de la concentration du substrat
L’équation est la suivante: 1/v = (Km + [S]) / (Vmax * [S])
1/v = (Km) / (Vmax * [S]) + ([S]) / (Vmax * [S])
1/v = (Km) / (Vmax * [S]) + 1 / Vmax
Vrai ou Faux. Une Allozyme est une isoenzyme provenant de gène allélique identique.
Faux.
Il s’agit d’une enzyme codée par différente allèle d’un même gène.
Que distinguent différentes isoenzymes entre-elles?
Les Isoenzymes ou isozymes sont des formes d’enzymes dont la structure primaire est génétiquement différente, mais dont l’appellation et la réaction catalysée est identique malgré parfois de petites différences catalytiques. Elle peuvent provenir d’un ou plusieurs organes ou types cellulaires.
Elle se distinguent par leur propriétés physicochimiques:
- Mobilité électrophorétique
- Résistance à l’inactivation thermique
- Résistance à l’inactivation chimique
Nommer les utilités cliniques du dosage de la LDH?
- marqueur de dommage cellulaire non-spécifique
- investigation des liquides pleuraux (↑ exsudat, ↓transudat)
- élévation en cas d’hémolyse ou de rhabdomyolyse
- classification des myélome
- isoforme LDH1> LDH2 = indicateur d’un infarctus du myocarde
