Semaine 4_Électrophorèse Flashcards
Quelle est l’utilité clinique de l’électrophorèse des protéines sériques ?
Elle est indiquée dans le dépistage des dyscrasies plasmocytaires (myélome multiple, du MGUS, la maladie de Waldenström, etc.).
La séparation et l’analyse des protéines sériques permet détecter une immunoglobuline monoclonale, une hypergammaglobulinémie et plus rarement une hypogammaglobulinémie.
Dessiner un profil normal d’électrophorèse des protéines sérique et nommer les protéines dans chacune des fractions.
Décrivez le patron des résultats d’électrophorèse des protéines (sériques et urinaires) et d’immunofixation qui seront générés chez des patients atteints de :
a) Macroglobulinémie de Waldenstöm,
b) Maladie à chaînes légères,
c) Maladie à chaînes lourdes,
d) Arthrite rhumatoïde.
a)
Électrophorèse des protéines sériques : Présence d’un pic monoclonal de type IgM kappa (75%) ou lambda (25%).dans les gamma ou bêtaglobulines
Électrophorèse des protéines urinaires : Présence de chaînes légères libres associés à une IgM monoclonale peut être visible, quoique très rare.
Immunofixation : Présence d’une bande monoclonale de type IgM kappa ou IgM lambda.
b)
Électrophorèse des protéines sériques : Hypogammagobulinémie visible.
Électrophorèse des protéines urinaires : Présence d’une bande de chaînes légères libres causé par une protéinurie de surchage (Bence-Jonces).
Immunofixation : Présence de bandes de chaînes légères (kappa et/ou lambda) non-appariées visible.
c)
Électrophorèse des protéines sériques : Présence d’un pic monoclonal peut être visible dans ~ la moitié des cas.
=> Pic monoclonal IgA habituellement en alpha2 ou bêtaglobulines.
=> Pic monoclonal IgM habituellement en bêta ou gammaglobulines.
=> Pic monoclonal IgG habituellement en gammaglobulines.
Électrophorèse des protéines urinaires : Absence de protéinurie de surchage des chaînes légères libres.
Immunofixation : Présence d’une bande dans l’électrophorèse des protéines qui correspond à une chaîne lourde non-appariée.
d)
Électrophorèse des protéines sériques : Profil normal ou inflammatoire à l’électrophorèse des protéines. Il est possible de voir une hypergammaglobulinémie ou un profil oligoclonal dans la région des gammaglobulines (plusieurs petits pics).
Immunofixation : Profil oligoclonal dans la région des gammaglobulines (plusieurs petites bandes sur plusieurs types d’immunoglobulines).
les régions sont à titre indicatif seulement / régions les plus courantes mentionné ci-dessus
Qu’est-ce qui explique le mieux une divergence dans les résultats d’un patient montrant une paraprotéinémie monoclonale importante avérée par électrophorèse des protéines sériques avec de faibles concentrations d’immunoglobulines totales ?
A. Interférence des médicaments
B. Réactivité croisée des chaînes légères libres
C. Interférence des anticorps hétérophiles
D. Précipitation d’immunoglobulines
E. Effet Prozone
E. Effet prozone: les interférences dues à l’effet prozone (effet crochet) ou à un excès d’antigène peuvent entraîner des résultats faussement bas. La présence d’un excès d’antigène empêche la formation d’un complexe antigène-anticorps stable. La diminution résultante de l’absorbance détectée conduit à une mesure quantitative faussement basse.
À quelle(s) modification(s) du tracé d’électrophorèse des protéines peut-on s’attendre dans les conditions suivantes (expliquer). (OCQ clin mars 1998 B2)
A. Myélome
B. Cirrhose hépatique
C. Inflammation aiguë
D. Emphysème
E. Insuffisance rénale
F. Anémie ferriprive
G. Échantillon de plasma et non de sérum
A. Myélome :
Présence d’un pic monoclonal important sur le tracé, généralement aperçu dans la région des gammaglobulines (mais peut être observé dans d’autres fractions).
B. Cirrhose hépatique :
Diminution de l’ensemble des fractions à l’exception de celles des beta-2 et des gammaglobulines (Compléments et Immunoglobulines), dont les protéines les composants ne sont pas synthétisé par le foie mais par les cellules du système immunitaire.
C. Inflammation aiguë :
Il y a augmentation des protéines positives (inclus a1-antitrypsine, a1-glycoprotéine acide, haptoglobuline, Complément, CRP) et diminution des protéines négatives (Albumine, Transferrine) de la phase aigue de l’inflammation.
Ceci peut se traduire par :
- Diminution de l’albumine
- Augmentation de la fraction alpha-1 (AAT, AAG)
- Augmentation de la fraction alpha-2 (Haptoglobine)
- Diminution ou Sans changement de la fraction beta-1 (Transferrine)
- Augmentation de la fraction beta-2 (Complément)
- Aucun changement de la fraction des gammaglobulines
D. Emphysème : Diminution de la fraction alpha-1 (Déficience en AAT est associé avec de l’emphysème)
E. Insuffisance rénale :
L’insuffisance rénale peut mener à une protéinurie lorsqu’il y a dommage rénal (au niveau de la membrane glomérulaire) ce qui conduit à un syndrome néphrotique.
Lors d’un syndrome néphrotique, le rein laisse passé l’ensemble des protéines exceptées
pour l’alpha-2 macroglobuline qui est de poids moléculaire très élevée. Sur l’électrophorèse des protéines ceci se traduit par :
- Baisse de la fraction de l’albumine
- Augmentation la fraction alpha-2.
- (Augmentation de la fraction beta-1 car l’apolipoprotéine B est également retenu)
- Braisse de la fraction des gammaglobulines
F. Anémie ferriprive : Augmentation de la région bêta 1 (Transferrine)
G. Échantillon de plasma et non de sérum : Présence d’un pic à la fin des beta-2/début gammaglobulines (Fibrinogène)
Quelle est l’indication clinique à l’électrophorèse des protéines urinaires ?
Qualifié une protéinurie:
- Sélective
- Semisélective
- Nonsélective
afin de pouvoir qualifié la protéinurie de glomérulaire ou de protéinurie tubulaire. (Syndrome néphrotique)
Patient ayant une dyscrasie plasmocytaire:
- détection de la présente de protéinurie monoclonale
- Suivi de thérapie et de progression des patients ayant une protéinurie monoclonale
- Dépistage de l’amyloïdose (inclus dans l’algorithme)
- Caractérisation du type de protéinurie (Glomérulaire, Tubulaire, Mixte)
Définir l’électroendosmose.
Le courant d’électroendosmose, créé par un support chargé négativement, est dirigé du pôle positif vers le pôle négatif (contraire de la migration électrophorétique) : il s’oppose à la migration électrophorétique des particules chargées négativement et augmente la vitesse de migration des particules chargées positivement.
L’électroendosomose est possible grâce à la création de 2 couches : 1ère couche (Immobile, fortement fixée aux charges négatives) et 2ème couche (Diffuse, majoritairement des cations mobiles)
- Il y a d’abord adsorption des ions OH- à la surface du support.
- Les cations s’agglomèrent autour des charges négative OH- et forment une couche d’ions immobiles
- Plus on s’éloigne, plus il y a de charges négatives dans le tampons jusqu’à ce qu’il y ait équilibre entre les concentrations de charges.
- Lorsqu’un courant est appliqué, les charge positives du tampon migre vers la cathode (dans le sens du courant). Lorsque l’électroendosmose est plus importante de la force du champ électrique appliqué pour un ampholyte de charge négative, celui-ci sera entraîné par les cations du tampon et migrera alors vers la cathode.
Caractéristiques principales de l’électrophorèse capillaire.
Combinaison de l’électrophorèse et de la chromatographie.
Colonne de silice de très faible diamètre
Voltage très élevé
Séparation réalisée en solution
Haut pouvoir de résolution
Exploitation de l’électroendosmose
Détection effectuée en cours d’analyse
Dissipation efficace de la chaleur générée
Rapidité d’exécution et automation
Quels sont les avantages de l’électrophorèse des protéines à haute résolution ?
Résolution accrue de l’électrophorèse des protéines => Séparation des fractions alpha (a1-glycoprotéine acide, AAT, Haptoglobine, a2-macroglobuline)
Sensibilité accrue (0,05g/L)
Utilités cliniques multiples et gammapathie
Anémie ferriprive
Anémie chronique, surcharge en fer
Hémolyse intravasculaire
Discuter des avantages et des inconvénients de l’électrophorèse des protéines sériques faite sur gel d’agarose vs par capillaire.
Électrophorèse sur gel d’agarose
Avantages :
- Moins dispendieux $
- Faible volume d’échantillon
- Absence d’interférence par des molécules absorbantes (Radio-contraste, Médicaments)
Désavantages :
- Plus cher $$$
- Artéfact au point d’application
- Moins sensible
- Temps-technique plus long
Électrophorèse capillaire
Avantages :
- Voltage élevé : ↓ Temps migration & ↑ Efficacité de la séparation
- Automation : ↓ temps-technique & + rapide que gel
- Plus sensible que gel pour identifier les anomalies
- Pas d’artéfact au point d’application
- Très faible volume d’échantillon
Désavantages :
- Plus cher $$$
- Interférence molécules absorbantes (Radio-contraste, Médicaments)
Lequel des énoncé suivant est faux?
A) L’utilisation de SDS dans le tampon d’électrophorèse permet l’obtention de charges positives pour l’ensemble des molécules.
B) De manière générale, la taille et la charge de la molécule influence la vitesse de migration électrophorétique.
C) Plus le voltage du champ électrique auquel est soumis le système électrophorétique augmente, plus la vitesse de migration est rapide.
D) L’adsorption non-spécifique est due au propriétés intrinsèques du support électrophorétique.
A) Elles deviennents chargées négativement.
Quels sont les indications cliniques pour l’immunotypage des immunoglobulines?
Discutez des principes des 2 méthodes couramment employés (immunofixation et immunosoustraction) ainsi que de leurs avantages et inconvénients.
Diagnostic et Suivi des gammapathies monoclonale
- Confirmer la présence ou l’absence d’une dysprotéinémie (ou dysprotéinurie) monoclonale
- Qualifier la conversion de la dysprotéinémie si apparition ou réapparition d’un pic à un nouvel endroit
- Déterminer l’isotype de la dysprotéinémie (ou dysprotéinurie) monoclonale
Immunofixation
L’immunofixation est une méthode d’immunomarquage sur gel d’agarose. Le premier puit est l’électrophorèse des protéines où l’ensemble des protéines sont précipité. La reconnaissance de la protéines par l’anticorps entraîne sa précipitation sur le gel qui est par la suite révélé par une coloration (habituellement violet acide). Les différentes chaînes d’immunoglobuline sont précipités par des anticorps anti-chaîne lourde ou anti-chaîne légère => Précipitation mono- et polyclonal
Avantages:
- Moins cher $
- Plus intuitive à interpréter
- Anticorps anti-IgD, anti-IgE, chaînes légères libres disponibles
Inconvénients:
- Long = Temps-technique important
Immunosoustraction
L’immunosoustraction est un principe inverse à l’immunofixation conventionnelle. C’est un principe négatif lors duquel le sérum est mélangé avec différents antisérums (IgG, IgA, IgM, κ, λ) chargés négativement. La reconnaissance immunologique spécifique de chacun des isotypes des chaînes lourdes et légères déplace la chaîne lourde ou légère reconnu se par la charge négative de l’anticorps. => Formation de complexe Ac-Ag dont la migration sera ainsi déplacée (pré-Albumine)
Avantage:
- Automatisée = Temps-technique beaucoup plus court
Inconvénients:
- Cher $$$
- Apprentissage nécessaire pour l’interprétation
- Ø d’anticorps anti-IgD, anti-IgE, chaînes légères libres disponibles
Décrivez le principe d’électrophorèse par focalisation isoélectrique.
Discuter de son utilisation en clinique.
Il s’agit de migration sur gel d’agarose avec gradient de pH. Le gradient est obtenu en faisant pré-migrer sur un gel d’agarose des ampholytes possédant différents pH.
Ce gradient permet au molécules d’être séparées selon leur point isoélectrique, soit le pH pour lequel leur charge est nulle.
Cette méthode offre une résolution élevée (~0.02 pI) ce qui permet d’identifier la présence de bandes oligoclonales. La détection de bandes oligoclonale aide d’ailleurs au diagnostic de pathologie du CNS, sclérose en plaque.
Associer les caractéristiques suivantes avec le bon type de support électrophorétique (Une information peut revenir plusieurs fois) :
A) Séparation selon le ratio Charge/Masse
B) Séparation par la Taille
C) Séparation par la Charge
D) Produit de l’adsorption
E) Produit de l’électroendosmose
Type de support électrophorétique:
1) Acétate de cellulose
2) Agarose
3) Polyacrylamide
4) Capillaire
1) A, E
2) A, (E)
3) A, B
4) A, D, E
Dessiner un schéma général d’un système électrophorétique.
Identifier chacune des composantes et leur fonction.
Pour un même patient nous effectuons une électrophorèse des protéines sur gel suivi d’une immunofixation. Nous obtenons les résultats suivants.
Donner votre interprétation. Expliquer brièvement en cas de discordance en l’électrophorèse des protéines sur gel et par capillaire ainsi que les étapes pour résoudre ou définir cette discordance.
Nous voyons sur l’électrophorèse capillaire une augmentation de la fraction beta-2 sans autre changement notable des différente fraction. Cette augmentation est également visible sur la ‘track’ ELP de l’électrophorèse sur gel.
Toutefois, l’immunotypage révèle une absence de bande monoclonale.
Il s’agirait ainsi de la présence d’une autre protéine absorbant autour de ~200nm ce qui explique sa présence sur les deux électrophorèse des protéines.
Le fibrinogène, par exemple, migre vers la fin de cette fraction. Une digestion à la reptilase ou une précipitation à l’éthanol avant la migration devrait éliminer l’élévation du pic ce qui corroborait la présence du fibrinogène. Le dosage de fibrinogène de l’échantillon serait également une autre alternative pour prouver sa présence dans l’échantillon.
Cette interférence est notamment courante chez les patients sous coagulothérapie ou encore si un échantillon de plasma a été décanté plutôt que sérique.
Pour un patient donné, l’hématologue-oncologue a demandé une électrophorèse des protéines sur gel ainsi qu’une immunofixation. Nous obtenons les résultats suivants. Donner votre interprétation. Expliquer brièvement en cas de discordance de l’électrophorèse des protéines sur gel et par capillaire ainsi que les étapes pour résoudre ou définir cette discordance.
Le profil électrophorétique est d’apparence normale. Un profil similaire est également observé sur l’électrophorèse des protéines sur gel. L’immunotypage révèle cependant la présence de chaîne lambda libre.
Il semble avoir 2 bandes de chaînes légère libres sur le gel, ceci peut être dû à un effet de zone (concentration trop élevé d’antigène qui entraîne l’apparition d’une zone colorée) ou encore à la présence véritable de 2 bandes. Une reprise de l’échantillon dilué peut résoudre ce problème de résolution.
Pour un même patient nous effectuons une électrophorèse des protéines sur gel suivi d’une immunofixation. Nous obtenons les résultats suivants. Donner votre interprétation ainsi que qu’une explication brève s’il y a une discordance en l’électrophorèse des protéines sur gel et par capillaire.
Le profil électrophorétique sur capillaire montre la présence d’un pic en région beta-1 avec une hypogammaglobulinémie concomittante.
À l’immunofixation une bande à la fin beta-1 est visible sur l’ensemble des puits au niveau du point d’application. Ce phénomène peut être dû à la polymérisation d’immunoglobuline (généralement observé avec des IgA, IgM ou chaîne légère libres). Une reprise avec l’échantillon pré-traité au beta-mercaptoéthanol ou DTT permet de dénaturé les polymères et ainsi empêche la précipitation. Il sera alors possible de confirmer la présence du pic monoclonal en beta-1 ainsi que de l’immunotyper.
