HC.2.6 - Next Generation Sequencing Flashcards
wat is sequencing?
de volgorde van de 4 nucleotiden -‘basen’- bepaald waaruit het DNA molecuul bestaat
wat zijn toepassingen van DNA-sequencing in de oncologie?
- DD
- therapiekeuze
- clonaliteitsanalyse
- oncogenetica
- weefselidentificatie
Hoe werkt de PCR reactie?
- Een dubbelstrengs DNA-molecuul gaat uit elkaar door temperatuurverhoging (> 90 graden celcius)
- De temperatuur gaat omlaag en primers (als starters) die complementair zijn aan een stukje van het template DNA worden toegevoegd.
- Basen worden toegevoegd.
- DNA-polymerase wordt toegevoegd.
- Nieuwe DNA-strengen worden gemaakt
Deze cyclus wordt bijvoorbeeld 30 keer herhaald waardoor meer dan een miljard DNA-moleculen ontstaan. Daarna kun je de volgorde van het stukje DNA gaan bepalen.
is A-T sterker of C-G?
C-G want deze heeft 3 waterstofbruggen en A-T heeft er 2
wat is next generation sequencing (NGS)?
Elk DNA molecuul wordt hierbij apart bekeken (single molecule) en allemaal tegelijk (massively parallel).
welke 2 vormen van NGS zijn er?
- amplication enrichment
- hybridization enrichment
wat is amplication enrichment (ook wel targeted NGS)?
er wordt een specifiek deel van het genoom gesequenced. Je gebruikt primers en je zorgt dat deze net voor en na de Target region binden. Dan start je de PCR reactie, hierdoor wordt dat specifieke stuk heel vaak gekopieerd. Daarna worden er adapters aangebracht voor de sequencing.
dit is per keer maar één fragment
wat is hybridization enrichment?
Op gefragmenteerd DNA molecuul worden er adapters aangebracht voor latere sequencing. Daarna binden er probes aan de stukjes DNA waarin je geïnteresseerd bent, de probes zijn gelabeld met biotine. De probes binden aan beads, de beads kun je vervolgens weer uitfilteren door middel van magnetisme of gewicht. Uiteindelijk heb je de stukjes van interesse over. De adaptoren die je hebt toegevoegd binden aan een flow-cel. De stukjes DNA maken een bocht naar de primer die aan de flowcel zit gebonden. En vervolgens begint de PCR reactie weer.
dus meerdere fragmenten tegelijk
hoe vindt sequencing plaats?
tijdens de synthese wordt er fluorising toegepast. hierbij krijgt elke nucleotide zijn eigen kleur
zie plaatje
hoe houden we patiënten uit elkaar op een flowcel?
door middel van een soort barcode. voor het stukje van interesse doen ze bijv. AAAA of CCCC en zo hou je ze uit elkaar
wat is coverage (deep sequencing)?
het aantal malen dat een base-positie (onafhankelijk) is bepaald. Hoe hoger de coverage des te dieper gesequenced is (nauwkeuriger).
- whole genoom sequencing <100 x deep
- targeted sequencing 500-1000 x deep
