Génome Chap 1 Flashcards
Enzymes de restriction
- Endonucléases d’origine bactérienne
- Coupent ADN bicaténaire au nv sites spé
- 3 types : I, II et III
Enzymes de types I et III
+ complexes car coupent ADN en dehors des sites de reconnaissance
Enzymes de type II
- Indispensables au génie génétique
- Reconnaissent séquence spé de 4 ou 6 ou 8 pb = site de restriction et coupent à l’intérieur de cette séquence
(généralement palindromiques)
Fragments d’ADN issus de l’action des enzymes de restriction
- Fragments de restriction : pouvant être séparés en fn de leur taille par électrophorèse en gel d’agarose/polyacrylamide
- Pour visualiser ces fragments : bromure d’éthidium = agent intercalant, émettant fluo rouge/orange sous UV
Coupures des enzymes de restriction
- Coupures franches : les 2 brins sont coupés au même endroit = bouts francs
- Coupures décalées : les 2 brins sont coupés à des endroits différents = extrémités cohésives=bouts cohésifs=bouts collants=extrémités protubérantes
Si conditions d’activité enzymatique sont les mêmes ?
- On peut digérer le même fragment d’ADN avec plusieurs enzymes de restrictions simultanément
- Sinon on doit le faire séquentiellement
Vecteurs utilisés pour le clonage ?
Plasmides et phagemides
Plasmides
- Type pUC, petite molécule d’ADN circulaire bicaténaire extrachromosomique de 3 à 10 kb
- Capable de se répliquer indépendamment du chromosome bactérien
- Bactéries peuvent se l’échanger
- Prod de grandes quantités car se multiplient dans bactéries hôtes
- D’origine naturelle mais ont été modifiés
- Molécules exogènes de 4 kb peuvent y être intégrées (jusqu’à 10 possible mais difficile)
Plasmides possèdent…
Son génome comprend :
☞ Origine de réplication
☞ Marqueurs de sélection (gènes)
☞ Site de polyclonage (polylinker/MCS)
Phagemides
- Type Bluescript, molécule hybride entre 1 plasmide et 1 phage
- Molécule d’ADN circulaire bicaténaire ou monocaténaire
- Taille de l’insert : 4 à 10 kb
Phagemides possèdent…
☞ Origine de réplication
☞ Site de polyclonage entouré de promoteurs
☞ Au moins 1 gène de résistance à 1 antibiotique
☞ 1 séquence du phage M13 avec 1 origine de réplication qui permet d’avoir 1 forme monocaténaire par co-infection avec 1 phage helper
Bactériophage
- Taille de l’insert : 10-20 kb
- Phage = virus bactérien
- ADN linéaire, bicaténaire de 50 kb
- Extrémités cohésives = séquences COS
- ADN phagique linéaire enveloppé dans 1 coque protéique = capside
Cosmide
- ADN db circulaire
- Plasmide (origine de réplication + site de polyclonage + gènes de sélection) et séquences COS nécessaires à l’encapsidation des particules de phage lambda
- Taille insertion : 40 kb
- ø de prod de virion car il n’y a pas de gène de phage
Clonage moléculaire : obtention d’un plasmide recombinant
- Insertion d’1 fragment d’ADN exogène dans 1 vecteur préalablement coupé par 1 enzyme de restriction reconnaissant 1 site de restriction unique dans le polylinker
- ADN exogène de l’organisme donneur et le vecteur sont digérés par la même enzyme
- Fragment à cloner et vecteur s’hybrident au nv de leurs extrémités complémentaires grâce à l’appariement des bases (Liaisons H)
- 1 ligase lie le fragment et le vecteur de façon covalente => plasmide recombinant
Clonage moléculaire : transformation bactérienne
- Intégrer le vecteur recombinant dans 1 micro-organisme qui va l’amplifier ou exprimer le gène qu’il contient = par transfo génétique
- 1 fois dans la ç, vecteur recombinant se réplique de façon autonome
Exemple de transformation bactérienne
- On soumet des bactéries à du chlorure de calcium à 4°C
- Bactéries sont alors dites “compétentes”, càd dans de bonnes conditions pour recevoir le vecteur, car la MP est devenue perméable grâce à formation transitoire de micro-pores
- Perméabilisation peut se faire par des chocs thermiques/calciques ou électriques (électroporation)
Obtention d’un vecteur recombinant en utilisant 2 enzymes
- Lorsque l’on veut orienter l’insertion du fragment (orientation importante si le fragment doit être transcrit)
- Bidirectionnel
Banque d’ADN génomique
Ensemble de vecteurs recombinants contenant chacun 1 morceau ≠ du génome de l’espèce étudiée
Obtention d’1 banque génomique nécessaire lorsqu’on veut…?
- Caractériser 1 séquence génomique particulière
- Établir 1 carte physique d’1 génome
- Séquencer à grande échelle 1 génome (en partie ou en totalité)
Fragments d’1 banque
Ne contiennent pas forcément 1 gène complet car ils sont coupés “au hasard” selon la position des sites de restriction de l’enzyme
Criblage d’1 banque
Consiste à sélectionner spécifiquement des clones bactériens contenant la séquence du gène recherché
Criblage par AC
- Si ADN cible = 1 gène et que l’on connaît la protéine codée par ce gène, on peut mettre au pt 1 AC dirigé contre cette prot d’intérêt
- Ces AC peuvent donc servir à mettre en évidence, indirectement, la présence de la séquence d’ADN d’intérêt
Restrictions de la technique de criblage par AC
❀ Technique possible que pour cribler les banques d’ADNc
❀ 1 vecteur de clonage d’expression + 1 promoteur bactérien en amont du site d’insertion obligatoires
Criblage par sonde nucléique
1) Réplique sur mb de nylon des plages de lyse sur boites de pétri (vecteur phagique)
2) Hybridation de la réplique et de la solution de sonde dénaturée et marquée
3) Lavages et révélation
4) Repérage et prélèvement des plages de lyse correspondant aux clones répondant positivement à l’hybridation