Génome Chap 1 Flashcards
Enzymes de restriction
- Endonucléases d’origine bactérienne
- Coupent ADN bicaténaire au nv sites spé
- 3 types : I, II et III
Enzymes de types I et III
+ complexes car coupent ADN en dehors des sites de reconnaissance
Enzymes de type II
- Indispensables au génie génétique
- Reconnaissent séquence spé de 4 ou 6 ou 8 pb = site de restriction et coupent à l’intérieur de cette séquence
(généralement palindromiques)
Fragments d’ADN issus de l’action des enzymes de restriction
- Fragments de restriction : pouvant être séparés en fn de leur taille par électrophorèse en gel d’agarose/polyacrylamide
- Pour visualiser ces fragments : bromure d’éthidium = agent intercalant, émettant fluo rouge/orange sous UV
Coupures des enzymes de restriction
- Coupures franches : les 2 brins sont coupés au même endroit = bouts francs
- Coupures décalées : les 2 brins sont coupés à des endroits différents = extrémités cohésives=bouts cohésifs=bouts collants=extrémités protubérantes
Si conditions d’activité enzymatique sont les mêmes ?
- On peut digérer le même fragment d’ADN avec plusieurs enzymes de restrictions simultanément
- Sinon on doit le faire séquentiellement
Vecteurs utilisés pour le clonage ?
Plasmides et phagemides
Plasmides
- Type pUC, petite molécule d’ADN circulaire bicaténaire extrachromosomique de 3 à 10 kb
- Capable de se répliquer indépendamment du chromosome bactérien
- Bactéries peuvent se l’échanger
- Prod de grandes quantités car se multiplient dans bactéries hôtes
- D’origine naturelle mais ont été modifiés
- Molécules exogènes de 4 kb peuvent y être intégrées (jusqu’à 10 possible mais difficile)
Plasmides possèdent…
Son génome comprend :
☞ Origine de réplication
☞ Marqueurs de sélection (gènes)
☞ Site de polyclonage (polylinker/MCS)
Phagemides
- Type Bluescript, molécule hybride entre 1 plasmide et 1 phage
- Molécule d’ADN circulaire bicaténaire ou monocaténaire
- Taille de l’insert : 4 à 10 kb
Phagemides possèdent…
☞ Origine de réplication
☞ Site de polyclonage entouré de promoteurs
☞ Au moins 1 gène de résistance à 1 antibiotique
☞ 1 séquence du phage M13 avec 1 origine de réplication qui permet d’avoir 1 forme monocaténaire par co-infection avec 1 phage helper
Bactériophage
- Taille de l’insert : 10-20 kb
- Phage = virus bactérien
- ADN linéaire, bicaténaire de 50 kb
- Extrémités cohésives = séquences COS
- ADN phagique linéaire enveloppé dans 1 coque protéique = capside
Cosmide
- ADN db circulaire
- Plasmide (origine de réplication + site de polyclonage + gènes de sélection) et séquences COS nécessaires à l’encapsidation des particules de phage lambda
- Taille insertion : 40 kb
- ø de prod de virion car il n’y a pas de gène de phage
Clonage moléculaire : obtention d’un plasmide recombinant
- Insertion d’1 fragment d’ADN exogène dans 1 vecteur préalablement coupé par 1 enzyme de restriction reconnaissant 1 site de restriction unique dans le polylinker
- ADN exogène de l’organisme donneur et le vecteur sont digérés par la même enzyme
- Fragment à cloner et vecteur s’hybrident au nv de leurs extrémités complémentaires grâce à l’appariement des bases (Liaisons H)
- 1 ligase lie le fragment et le vecteur de façon covalente => plasmide recombinant
Clonage moléculaire : transformation bactérienne
- Intégrer le vecteur recombinant dans 1 micro-organisme qui va l’amplifier ou exprimer le gène qu’il contient = par transfo génétique
- 1 fois dans la ç, vecteur recombinant se réplique de façon autonome
Exemple de transformation bactérienne
- On soumet des bactéries à du chlorure de calcium à 4°C
- Bactéries sont alors dites “compétentes”, càd dans de bonnes conditions pour recevoir le vecteur, car la MP est devenue perméable grâce à formation transitoire de micro-pores
- Perméabilisation peut se faire par des chocs thermiques/calciques ou électriques (électroporation)
Obtention d’un vecteur recombinant en utilisant 2 enzymes
- Lorsque l’on veut orienter l’insertion du fragment (orientation importante si le fragment doit être transcrit)
- Bidirectionnel
Banque d’ADN génomique
Ensemble de vecteurs recombinants contenant chacun 1 morceau ≠ du génome de l’espèce étudiée
Obtention d’1 banque génomique nécessaire lorsqu’on veut…?
- Caractériser 1 séquence génomique particulière
- Établir 1 carte physique d’1 génome
- Séquencer à grande échelle 1 génome (en partie ou en totalité)
Fragments d’1 banque
Ne contiennent pas forcément 1 gène complet car ils sont coupés “au hasard” selon la position des sites de restriction de l’enzyme
Criblage d’1 banque
Consiste à sélectionner spécifiquement des clones bactériens contenant la séquence du gène recherché
Criblage par AC
- Si ADN cible = 1 gène et que l’on connaît la protéine codée par ce gène, on peut mettre au pt 1 AC dirigé contre cette prot d’intérêt
- Ces AC peuvent donc servir à mettre en évidence, indirectement, la présence de la séquence d’ADN d’intérêt
Restrictions de la technique de criblage par AC
❀ Technique possible que pour cribler les banques d’ADNc
❀ 1 vecteur de clonage d’expression + 1 promoteur bactérien en amont du site d’insertion obligatoires
Criblage par sonde nucléique
1) Réplique sur mb de nylon des plages de lyse sur boites de pétri (vecteur phagique)
2) Hybridation de la réplique et de la solution de sonde dénaturée et marquée
3) Lavages et révélation
4) Repérage et prélèvement des plages de lyse correspondant aux clones répondant positivement à l’hybridation
Construction d’1 banque d’ADNc
- ARNm produits dans 1 tissu donné sont représentatifs de ce tissu
- ARNm sont fragiles : manipulation délicate => transformation en ADN bicaténaire, + facile à manipuler et adapté aux vecteurs de clonage = ADNc
- 1 banque d’ADNc contient donc des fragments qui codent pour des prot
- Ces fragments pourront être transcrits en ARNm qui seront à leur tour traduits en prot
Généralités génome humain normal et pathologique
- Avec la séquence d’1 gène, on peut souvent expliquer en partie le rôle de la prot codée par ce gène et donc la fn du gène
- Les mutations altérant la séquence, elles altèrent également la fn
≠ approches du génome humain normal et pathologique
- Identification de l’anomalie sur l’ADN
- Utilisation des ARNm exprimés en conditions normales et pathologiques
- Études des prot et de leur fn notamment des fn de régulation
Criblage différentiel
- Technique qui permet de comparer des ADNc spécifiques d’1 tissu donné en conditions normale et pathologique
- Si la banque d’origine est réalisée sur 1 tissu pathologique, on pourra mettre en évidence les ARNm qui ne sont exprimés qu’en condition pathologique
- ⚠️Technique efficace pour les ARNm les + abondants
Criblage par banque soustraite
- Variante de la technique de criblage différentiel permettant d’isoler les ARNm rares
- Chromato sur colonne contenant de la streptavidine
(NB : regarder les schémas fiche p 4)
Identification de mutation : analyse des ADN simples brins
PCR -> 2 séquences qui ne diffèrent que par 1 pb -> dénaturation -> électrophorèse sur gel en conditions normale et pathologique
Hétéroduplex
- 1 hétéroduplex d’ADN est une molécule d’ADN db portant au moins 1 mésappariement
- Sans mésappariement = homoduplex
Identification de mutation : analyse des hétéroduplex
- Hétéroduplex et homoduplex ne migrent pas au même endroit lors d’1 électrophorèse sur gel d’agarose : mésappariement forme 1 “bulle” qui retarde la migration sur gel
- Donc hétéroduplex migre moins loin
Hybridation génomique comparative = HCG
- L’HCG identifie les gènes délétés ou au contraire présents de trop nbreuses fois (amplifiés ou dupliqués =cancers)
- ⚠️ interdiction d’utiliser le voc de l’expression
Méthode HCG
- Chaque ADN génomique (normal et tumoral) est isolé, fragmenté et marqué avec 1 marqueur fluorescent différent : rouge (tumeur) et vert (normal)
- Ces 2 gènes sont ajoutés à 1 micropuce d’ADN dans laquelle chaque point correspond à 1 séquence bien précise du génome normal qui est ainsi cartographié
- L’ADN génomique (préalablement dénaturé et donc simple brin) va s’associer spécifiquement dans les puits où se trouve 1 amorce nucléotidique complémentaire de sa séquence
Interprétation HCG
◎ + gène est présent, + point fluo est intense
◎ Si point jaune (fusion vert + rouge) = les 2 gènes normaux et tumoraux sont présents en quantité équivalente
◎ Si point seulement vert = seul gène normal est hybridé donc gène tumoral absent = délété
◎ si point seulement rouge = gène tumoral présent en de nbreux exemplaires
N.B : 1 calcul est réalisé par ordinateur en fn du rapport fluo vert/fluo rouge de chaque puits
Régulation de l’expression des gènes
- Passe le + svt par la reconnaissance d’1 prot régulatrice et d’1 segment régulateur d’ADN = prot spé de liaison à l’ADN
- Pathologie peut être due à 1 dérèglement dans la régulation de l’expression des gènes
Chromato permettant d’isoler les prot d’intérêt d’1 extrait çlaire
- Les prot sortent de la colonne parfois en se chevauchant
- Chaque fraction de chromato obtenue est mise en présence d’1 fragment d’ADN marqué
Retard sur gel
- Détecte les prot de liaison à des séquences spécifiques d’ADN connus pour contrôler l’expression d’1 gène particulier
- > Molécules d’ADN migrent vers l’électrode + en fn de la taille
- > Si ADN lié à 1 prot, sa migration est ralentie = retard sur gel
Chromatographie d’affinité de l’ADN
- Technique puissante de purification de prot spé de liaison à l’ADN
- Oligonucléotides d’ADN db, variés, sont synthétisés par voie chimique et sont fixés sur 1 matrice insoluble poreuse comme de l’agarose
- Cette matrice est alors utilisée pour construire 1 colonne -> celle-ci va alors lier sélectivement toutes les prot de liaison à l’ADN
Empreinte d’ADN : objectifs
À partir des ç, 1 fragment d’ADN particulier est isolé :
- Soit on veut savoir s’il s’agit d’1 segment régulateur et s’il contient 1 site de liaison à 1 prot régulatrice
- Soit on sait déjà que c’est 1 ADN régulateur et on veut savoir où se fixe la prot exactement
- Soit on sait que l’ADN et la prot interagissent ensemble et on veut savoir si la prot mutée est tjrs capable de se fixer à l’ADN
Empreinte d’ADN : principe
1) Fragment d’ADN duplex marqué radioactivement au 32P à 1 de ses extrémités
2) On ajoute 1 nucléase / 1 produit chimique qui coupe l’ADN duplex sur 1 des 2 brins
3) Prot régulatrice fixée sur son segment régulateur le cache et le protège de la coupure
4) Molécule d’ADN est dénaturée pour séparer les 2 brins
5) 1 seul brin est marqué donc ce sont les fragments issus de ce brin qui sont visibles
6) Cette famille d’ADN simple brin est ensuite séparée sur 1 gel d’électrophorèse
7) Gel des bandes d’ADN en présence de la prot est comparé à celui obtenu sans la prot
8) Prot qui a protégé l’ADN de la coupure laisse 1 vide sur le gel = empreinte ADN = footprint
