Bioch : LES SYSTÈMES CRISPR/CAS

Question 1

Qu’est-ce que le CRISPR ?

Answer 1

Courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées

Question 2

Structure des CRISPR ?

Answer 2

● 21 à 37 pb
● régulièrement espacées par des séquences appelées “spacer”
● uniques de 20 à 40 pb

Question 3

Qu’est-ce que le CAS ?

Answer 3

CRISPR Associated Protein

Question 4

Objectif de la thérapie génique ?

Answer 4

corriger et réparer un gène défectueux responsable d’une pathologie

Question 5

Quels sont les outils nécessaire à la thérapie génique ?

Answer 5

● Connaissance de la séquence du génome humain et relation mutation-pathologie
● Outils de la biologie moléculaire
○ Amplification génique (PCR)
○ Découpage ADN (enzyme de restriction)
○ Vecteurs transgéniques
○ ARN interférence
○ Recombinaison homologue
○ Ciseaux moléculaire

Question 6

Quels sont les éléments qui compose le CRISPR-Cas9 ?

Answer 6

2 éléments :
* 1 brin d’ARN de séquence homologue à celle de l’ADN que l’on veut exciser
* endonucléase : Cas 9
Dans la cellule, le brin d’ARN va reconnaître la séquence homologue sur l’ADN et s’y placer. L’enzyme Cas9 se charge alors de couper la chaîne ADN complémentaire à ce brin ARN. Le trou laissé par le passage du CRISPR-Cas9 pourra alors être comblé par n’importe quel nouveau fragment d’ADN

Question 7

Relation dans le génome de CAS et CRISPR ?

Answer 7

● locus CRISPR adjacent aux gènes Cas
● séparé par une séquence de 300 à 500 pdb : séq “leader”

Question 8

Localisation des systèmes CRISPR-Cas ?

Answer 8

• Génomes archées ++
• Génomes bactériens ++
  absent des eucaryotes

Question 9

Quels sont les éléments qui varient selon les systèmes CRISPR Cas ?

Answer 9

● séquences PAM courte séquence d’ADN qui sert de signal de liaison pour cas9
● nombre et le type de protéines Cas

Question 10

Rôle “initial” des systèmes CRISPR Cas ?

Answer 10

système immunitaire pour procaryote
Protection des bactéries contre les infections par des phages et des plasmides selon la séq nucléotidique des espaceurs présents dans le locus CRISPR
=> système est ADAPTATIF

Question 11

Production de l’ARNcr ?

Answer 11

• associés à une ou plusieurs protéines Cas
• complexes de surveillance à l’intérieur des µ-organismes en attente d’une infection ou d’une invasion par un ac nucléique étranger
• ARNcr reconnaîtra la séquence envahissante à l’aide d’un appariement complémentaire
  protéines Cas pourront ensuite couper le matériel génétique envahisseur, protégeant ainsi la cellule

Question 12

Qu’est-ce que l’édition du génome ?

Answer 12

Modification d’un fragment du génome en remplaçant sa séquence par une séquence choisie

Question 12

Caractéristiques de la modification / réparation par recombinaison homologue ?

Answer 12

utilisée par les C pour réparer les lésions touchant les deux brins de l’ADN
nécessite d’avoir un ADN-modèle

Question 13

Caractéristiques de la Modification / réparation par raboutage ?

Answer 13

Apparition de mutation –> ADN modèle qui va réparer l’ADN abimé

Question 14

Quels sont les ARN qui composent le système natif CRISPR-Cas ?

Answer 14

• crRNA = CRISPR-RNA
• tracrRNA = trans-activating crRNA

Question 15

Rôle du crRNA ?

Answer 15

Définit la cible génomique pour cas9

Question 16

Rôle du tracrRNA ?

Answer 16

nécessaire à la précision et à la coupure de l’ADN

Question 17

Quelles sont les possibilités d’action de CRISPR Cas 9 ?

Answer 17

1. S’associer à l’ARNg (guide) cette association avec le “guide RNA” permet une coupure spécifique de plusieurs régions
2. Se lier à la cible DNA Liaison par le 5’ du guide RNA séquence en amont d’un motif PAM
3. Couper l’ADN coupure et production d’extrémité franches de 3 nucléotides en 5’ de l’ARN guide

Question 18

Quelles sont les conditions à respecter pour que CRISPR-cas9 puisse ê utilisé pour modifier toute cible génomique désirée ?

Answer 18

• Séquence soit unique
• Séquence soit située juste en amont d’un séq PAM

Question 19

Comment est éviter le problème du hors cible lors de l’utilisation des CRISPR-Cas ?

Answer 19

Modifiant l’activité nucléase de la cas9
*ex :
* nickase cas9 –> capable de faire 1 seule coupure
*dCas9 : dead → morte donc ne coupe plus *

Question 20

Application de l’utilisation de CRISPR-Cas ?

Answer 20

• Hémoglobinopathies (maladies du sang)
• Cécité
• SIDA
• Mucoviscidose (fibrose kystique pulmonaire)
• Dystrophie musculaire de Duchenne
• Maladie Huntington
• CRISPR Typing : le typage