Bioch : ADN recombinant 3

Question 1

Définition des cosmides ?

Answer 1

Vecteur artificiel constitués d’un plasmide classique auquel on a ajouté les séqu d’un phage lambda

Question 2

Origines des vecteurs ?

Answer 2

Origine naturelle ++ comme plasmides et bactériophages, mais ont été largement modifiés

Question 3

Quelles sont les propriétés attribuées aux vecteurs ?

Answer 3

• Capacité de réplication autonome dans une cellule hôte donnée
• Possession d’un site de clonage multiple = MCS (insertion du fragment d’ADN) → sites uniques de restriction → sites de digestion enzymatique sur le vecteur → là où il peut être ouvert
• Insertion d’un fragment d’ADN
• Présence d’un marqueur de sélection → permet d’identifier la bactérie contenant notre protéine recombinante

Question 4

Définition des plasmides ?

Answer 4

Petites molécules d’ADN double brin extra Xsomique circulaire de 3 à 10 kb, capable de se répliquer indépendamment du Xsome bactérien et pouvant être transféré d’une cellule à l’autre

Question 5

Quelles sont les zones qui composent un plasmide ?

Answer 5

• Origine de réplication (Ori) dans la bactérie
• Marqueur de sélection
• Site de clonage multiple
• Promoteur
• Codon stop

Question 6

Caractéristiques des marqueurs de sélection ?

Answer 6

Nbx sites de restriction uniques dans tout le plasmide permettant l’insertion du fragment de l’ADN d’intérêt après de le promoteur

Question 7

Caractéristiques du promoteur dans les plasmides ?

Answer 7

Exprime la protéine d’intérêt => besoin de cloner la seq d’ADN en phase avec le promoteur

Question 8

Définition des enzymes de restriction ?

Answer 8

• Endonucléases
• Coupe un fragment d’ADN 2BLE brin dans le sens 5’→3’
• Agissent au niveau d’une seq de nucléotides caractéristiques : dite de restriction

Question 9

Rôles des enzymes de restriction chez les bactéries ?

Answer 9

Permettent de couper et détruire l’ADN étranger (ex viral)

Question 10

Comment la bactérie se protège-t-elle des enzymes de restriction ?

Answer 10

Par des modification de l’ADN de type méthylation

Question 11

Nomenclature des enzymes de restriction ?

Answer 11

• Première lettre (majuscule) : genre bactérien
• 2ème/3ème : espèce de bactérie
• Lettre majuscule à la fin : souche bactérienne ou a été trouvée l’enzyme
• Chiffre romain : numéro d’ordre de découverte dans une même bactérie

Question 12

Quels sont les types de coupures réalisées par les enzymes de restriction ?

Answer 12

2 :
* Cohésive (sticky)
* Franche (blunt) au niveau d’un site palindromique

Question 13

Quel est le principe de l’insertion de l’ADN d’intérêt dans le vecteur ?

Answer 13

• Digestion 1 heure dans un tampon adapté et à T° optimale de l’enzyme
• Digestion par les enzymes 1 et 2 → Création de 2 extrémités cohésives → Libération d’un petit bout d’ADN lors de l’ouverture du plasmide

Question 14

Quels sont les risques si l’on ouvre le plasmides avec deux enzymes identiques ?

Answer 14

On obtient des bouts collants → 2 extrémités cohésives (ou franches) complémentaires avec les extrémités du vecteur plasmide → Plasmide risque de se refermer sur lui-même

Question 15

Comment éviter la réinsertion du fragment d’intérêt lors d’utilisation de deux enzymes de restriction identiques ?

Answer 15

Il est nécessaire de séparer les 2 (plasmides et ADN) produits de la digestion du vecteur et de purifier le vecteur digéré pour la suite du
clonage

Question 16

Comment éviter la fermeture du vecteur lors d’utilisation de deux enzymes de restriction identiques ?

Answer 16

Utiliser une phosphatase alcaline qui permet d’enlever le phosphate en 5’ du vecteur

Question 17

Quel est intérêt d’utiliser deux enzymes différentes lors de la digestion pour l’ouverture du vecteur ?

Answer 17

Permet une insertion orientée de l’ADN à cloner dans le vecteur et limite la religation du vecteur sur lui-même

Question 18

Quelle méthode est utilisée pour la purification du vecteur digéré ?

Answer 18

électrophorèse

Question 19

Définition de l’électrophorèse ?

Answer 19

Méthode de séparation de particules chargées électriquement par migration différentielle sous l’action d’un champ électrique

Question 20

De quoi dépend la migration de l’échantillon sur l’électrophorèse ?

Answer 20

=> De la charge et de la géométrie des particules
- Les fragments d’ADN (chargés - grâce au phosphate) migrent de façon inversement proportionnelle à la taille

Question 21

Quel est le matériel utilisé pour réaliser l’électrophorèse ?

Answer 21

Gel d’agarose et solution d’électrolyte qui recouvre le gel

Question 22

Méthode de réalisation de l’électrophorèse ?

Answer 22

1. Dépôt d’échantillons dans les puits du gel. Les échantillons sont supplémentés d’un
   bleu de dépôt (tampon) pour pouvoir visualiser l’évolution de la migration
2. Par le champ électrique, migration des fragments d’ADN et séparation en fonction de leur taille et de la géométrie
3. Révélation du gel avec du bromure d’éthidium (BET= intercalent fluorescent de l’ADN) → s’intercale entre les bases de l’ADN et il permet de voir les fragments d’ADN sous UV (produit cancérigène)
4. Obtention de 2 bandes = vecteur digéré et petit fragment extrait du vecteur
5. Utilisation marqueur de PM avec des fragments d’ADN de taille connue → permet de déterminer la taille des bandes d’intérêt par comparaison au marqueur
6. Récupération de la bande d’intérêt (ex vecteur) : purifie sur une colonne (fixation de l’ADN sur la colonne, lavage, puis élution
   de l’ADN purifié) → on récupère ainsi l’ADN du vecteur digéré, utilisé pour le clonage + permet aussi d’éliminer en partie les traces de vecteur non digéré

Question 23

Comment se fait la ligation du fragment d’ADN d’intérêt dans le vecteur ?

Answer 23

On a créé des extrémités collantes/cohésives complémentaires → insertion du fragment d’ADN dans le vecteur qu’on a ouvert et purifié → hybridation au niveau des extrémités covalentes
→ Utilisation ligase → va réaliser des liaisons phosphodiesters (covalentes) entre 2 molécules d’ADN
=> on obtient un plasmide recombiné

Question 24

Comment se fait la transformation des bactérie (ou transfection des cellules euca) ?

Answer 24

1) Mélange de plasmides et de bactéries compétentes sur glace
2) Il y a 2 méthodes :
● Choc thermique : bain marie entre 37° et 42° pendant 30 sec à 1 min puis on le remet
sur la glace
● Électroporation : création d’un arc électrique sur la membrane de la bactérie ⇒ pour que les plasmides pénètrent dans les bactéries
→ 2 techniques permettent de faire des pores transitoires dans la membrane de la bactérie et faciliter l’entrée des plasmides
3) Ajout de milieu nutritif aux bactéries, et croissance pendant 1 heure à 37°C pour permettre l’expression des protéines de résistances aux antibiotiques pour la sélection ultérieure

Question 25

Quelles sont les bactéries que nous pouvons obtenir après le transformation ?

Answer 25

● Bactéries n’ayant pas intégré de plasmide
● Bactéries ayant intégré un plasmide mais sans ADN d’intérêt
● Bactéries ayant intégré un plasmide ayant l’ADN d’intérêt

Question 26

Comment sélectionner les bactéries ayant intégré un plasmide avec l’ADN d’intérêt ?

Answer 26

1. Étalement des bactéries sur une boite contenant un milieu gélosé et un ATB : seules bactéries transformées, pourront se multiplier car c’est le plasmide qui porte un gène de résistance contre l’ATB
2. Une fois que l’on a sélectionné les bactéries transformées, on va amplifier leur nombre par culture
   => 1ère vérification

Question 27

Comment sélectionner les bactéries ayant intégré un plasmide avec l’ADN d’intérêt après un 1er passage avec ATB ?

Answer 27

• Insert sur le gène B-galactosidase normalement ne peut plus hydrolyser les galactoside
  1) Mise en culture des bactéries sur un milieu supplémenté en X-gal (galactoside qui devient bleu après hydrolysation)
  2)
  
  • Colonies blanches ⇒ l’insert est à l’intérieur ⇒ donc cela nous intéresse
  • Colonies bleues ⇒ pas d’insert du tout donc cela ne va pas nous intéresser ou l’insert est en dehors du gène lac Z donc au mauvais endroit

Question 28

Comment réaliser l’extraction du plasmide recombiné dans les bactéries ?

Answer 28

=> RÉCUPÉRER le plasmide
1. Lyse bactérienne par détergent en milieu alcalin pour libérer l’ADN génomique et plasmidique → ADN génomique et les protéines sont précipités par de l’acétate de sodium → précipité est séparé par centrifugation → surnageant contenant l’ADN plasmidique
2. L’ADN plasmidique est alors précipité à froid, lavé à l’éthanol 70% (30% d’eau permet de solubiliser le sel qui reste) → dissout ce culot dans un tampon adéquat (eau) /!\ étape peut être réalisée avec des colonnes de purification d’ADN /!\
3. Dosage des acides nucléiques à 260 et 280 nm afin de s’assurer qu’il n’y a pas de contamination protéique

Question 29

Quelles sont les condition nécessaire à la précipitation de l’ADN plasmidique ?

Answer 29

Sel, alcool 100% et froid

Question 30

Que permet le dosage à 260 nm ?

Answer 30

Doser les acides nucléiques
● ADN double brin : 50 µg/mL
● ARN ou ADN simple brin : 40 µg/mL

Question 31

Que permet le dosage à 280 nm ?

Answer 31

Doser les protéines notamment les acides aminés aromatiques : Tryptophane/Tyrosine

Question 32

Calcul pour vérifier la contamination protéique de l’ADN plasmidique ?

Answer 32

• Contamination protéique, calcul du ratio (260/280) qui doit être compris entre :
  1,8 < 𝐷𝑂 260/𝐷0 280 < 2
• Si le contamination protéique : le ratio va diminuer
  => l’ADN sera pur si le ratio est compris entre 1,8 et 2

Question 33

Quelles sont les méthodes de vérification possibles pour vérifier la construction du plasmide ?

Answer 33

a. Vérification rapide par PCR
b. Vérification rapide par restriction
c. Vérification par séquençage : principe de la méthode de Sanger

Question 34

Principe de la vérification rapide par PCR ?

Answer 34

bactéries transformées peuvent contenir :
● Le plasmide recombiné (contenant l’ADN qui nous intéresse)
● Le vecteur refermé sur lui-même (ne contenant pas le gène d’intérêt)
=> réalise une PCR avec les amorces ayant
servi à l’obtention de l’insert et on observe les résultats sur un gel d’agarose
=> Quand il y a le vecteur seul il n’a aucun signal/produit détecté
=> Plasmide recombiné il y a un produit visible