Bioch : ADN recombinant 2 Flashcards

Le Pabic

1
Q

Comment fonctionne la PCR en temps réel ?

A
  • On obtient cycle par cycle la quantification en ADN
  • Basée sur la détection d’un reporter fluorescent
  • Signal obtenu est proportionnel à la quantité d’amplicons
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Q

Précision de la PCR en temps réelle selon la phase ?

A
  • Haute précision pendant la phase exponentielle
  • Variabilité importante à la phase plateau
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3
Q

Quelles sont les modalités (technique, matériel) utilisées pour les PCR classique et en temps réel ?

A
  • PCR conventionnelle : sur gel d’agarose, qualitatif (visible à partir du 20ème cycle)
  • PCR en temps réel : courbe de fluorescence, quantitatif
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4
Q

Pourquoi faire la PCR en temps réel ?

A

→ Définir le seuil = niveau de fluorescence atteint au milieu de la phase exponentielle,
représenté par une droite
→ Attribuer un cycle seuil (Ct) = base de la quantification.

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5
Q

Qu’est-ce que le “cycle treshold” ?

A

CT = nb de cycles d’amplification nécessaire pour obtenir un signal fluorescent, statistiquement significatif par rapport au bruit de fond

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6
Q

A quoi sert CT (cycle treshold) ?

A

Vraiment déterminer la quantité d’ADN produit lors de la PCR

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7
Q

Que signifie la valeur du cycle treshold ?

A

Plus Ct est petit, plus l’échantillon est
concentré
→ existe une relation linéaire entre la valeur du CT et le log du nombre de copies

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8
Q

Importance du CT ?

A
  • Ct = directement lié à la quantité d’ADN cible présent au début de la PCR → + le Ct est petit + la quantité d’ADN présente au départ est ↑
  • Tous les calculs de quantification sont effectués à partir du Ct
    • le CT est petit, + l’échantillon est concentré en ADN et l’ADN a été détecté avant les autres
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9
Q

Comment fonction la PCR en temps réel ?

A
  • Appareil : thermocycleur + détecteur de la fluorescence
  • Détection : fluorescence émise par un rapporteur → PCR classique mais on aura
    besoin d’une sonde en + des deux amorces
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10
Q

Quelles sont les “chimies” utilisées pour la PCR en temps réel ?

A
  • Chimie Sybr Green
  • Chimie Taqman
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11
Q

PCR avec la Chimie Taqman ?

A

= Sonde d’hybridation spécifique, oligonucléotide complémentaire : s’hybride en même tps que les amorces
* En 5’ → fluorochrome reporter
* En 3’ → quencher fluorescent → Fluorescent Resonance Energy Transfer au niveau de la manipulation

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12
Q

Fonctionnement de la chimie Taqman ?

A

FRET possède un reporter (haute énergie) en 5’ + quencher (faible énergie) en 3’, (= fluorochromes)
1) début, pas de signal fluorescent émis par le reporter quand la sonde est intacte → quencher “inhibe”
2) sonde hydrolysée lors de l’étape d’élongation par l’activité 5’ 3’ nucléase de l’ADN polymérase → libère le reporter → on a une fluorescence
3) Quand polymérisation complétée → pour chaque molécule d’ADN synthétisée, un reporter émet de la fluorescence → fluorescence proportionnelle aux taux d’hydrolyse de la sonde hybridée donc à la quantité de produit d’amplification

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13
Q

PCR avec la chimie Sybr Green ?

A
  • Fluorochrome non spécifique → s’accroche sur ttes les séq d’ADN → sondes marquées
  • “intercalant” fluorescent quand il est fixé à l’ADN, on mesure la fluorescence en fin d’élongation
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14
Q

Fonctionnement de la chimie SYBR Green ?

A
  • Avant amplification : sybr green émet peu de fluorescence, juste le bruit de fond
  • Après amplification : sybr se fixe sur l’ADN double brin → émet une fluorescence donc ↑ du signal
  • Emission de la fluorescence mesurée à la fin de chaque cycle d’élongation
  • Fluorescence ↓ lorsque l’ADN est dénaturé à l’étape suivante
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15
Q

Quelles sont les applications de la PCR en temps réel ?

A
  • Quantification relative
  • Quantification absolue
  • Génotypage
  • Quantification relative des transcrits
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16
Q

Qu’est-ce que la quantification relative ? (PCR)

A

A partir d’ARN rétro-transcrit en ADNc par RT-PCR → niveau d’expression d’un gène par rapport à̀ un gène de référence
* Ex :
- comparer C cancéreuses et C normales grâce aux taux d’expressions des C
- combien de fois il y a eu amplification ou diminution du gène qui nous intéresse
- rechercher des délétions

17
Q

Qu’est-ce que la quantification absolue ?

A
  • Détecter des agents pathogènes, recherche d’OGM,
  • Si abs d’amplification, on cherchera une diminution, etc…
18
Q

Qu’est-ce que le génotypage PCR ?

A

Analyse des polymorphismes (SNP) par discrimination allélique

19
Q

Objectif de la Quantification relative des transcrits ? (PCR)

A

Comparer l’expression des gènes dans différentes situations (cas normal + cas pathogène)

20
Q

Fonctionnement de la quantification relative des transcrits ?

A

On a :
* Gène cible = gène d’intérêt que l’on souhaite quantifier
* Gène de référence = exprimé de façon stable /!\ il a toujours le même Ct → normalisation de la quantité́ d’ARN ou d’ADN utilisée en RT-PCR
* Echantillon calibrateur = échantillon de référence (situation normale) → calcul par
rapport à lui

21
Q

Calcul de la quantification relative ?

A

Quantification relative (△Ct) = calculer la différence de Ct du gène cible entre un
échantillon X (celui qu’on étudie) et un échantillon calibrateur (échantillon de référence)

22
Q

Différence référence et calibrateur pour la quantification relative (PCR) ?

A

→ Référence : gène exprimé de façon stable c’est à dire 16S ou 18S
→ Calibrateur : c’est le point qui sert à comparer