Bioch : ADN recombinant 2 Flashcards
Le Pabic
Comment fonctionne la PCR en temps réel ?
- On obtient cycle par cycle la quantification en ADN
- Basée sur la détection d’un reporter fluorescent
- Signal obtenu est proportionnel à la quantité d’amplicons
Précision de la PCR en temps réelle selon la phase ?
- Haute précision pendant la phase exponentielle
- Variabilité importante à la phase plateau
Quelles sont les modalités (technique, matériel) utilisées pour les PCR classique et en temps réel ?
- PCR conventionnelle : sur gel d’agarose, qualitatif (visible à partir du 20ème cycle)
- PCR en temps réel : courbe de fluorescence, quantitatif
Pourquoi faire la PCR en temps réel ?
→ Définir le seuil = niveau de fluorescence atteint au milieu de la phase exponentielle,
représenté par une droite
→ Attribuer un cycle seuil (Ct) = base de la quantification.
Qu’est-ce que le “cycle treshold” ?
CT = nb de cycles d’amplification nécessaire pour obtenir un signal fluorescent, statistiquement significatif par rapport au bruit de fond
A quoi sert CT (cycle treshold) ?
Vraiment déterminer la quantité d’ADN produit lors de la PCR
Que signifie la valeur du cycle treshold ?
Plus Ct est petit, plus l’échantillon est
concentré
→ existe une relation linéaire entre la valeur du CT et le log du nombre de copies
Importance du CT ?
- Ct = directement lié à la quantité d’ADN cible présent au début de la PCR → + le Ct est petit + la quantité d’ADN présente au départ est ↑
- Tous les calculs de quantification sont effectués à partir du Ct
- le CT est petit, + l’échantillon est concentré en ADN et l’ADN a été détecté avant les autres
Comment fonction la PCR en temps réel ?
- Appareil : thermocycleur + détecteur de la fluorescence
- Détection : fluorescence émise par un rapporteur → PCR classique mais on aura
besoin d’une sonde en + des deux amorces
Quelles sont les “chimies” utilisées pour la PCR en temps réel ?
- Chimie Sybr Green
- Chimie Taqman
PCR avec la Chimie Taqman ?
= Sonde d’hybridation spécifique, oligonucléotide complémentaire : s’hybride en même tps que les amorces
* En 5’ → fluorochrome reporter
* En 3’ → quencher fluorescent → Fluorescent Resonance Energy Transfer au niveau de la manipulation
Fonctionnement de la chimie Taqman ?
FRET possède un reporter (haute énergie) en 5’ + quencher (faible énergie) en 3’, (= fluorochromes)
1) début, pas de signal fluorescent émis par le reporter quand la sonde est intacte → quencher “inhibe”
2) sonde hydrolysée lors de l’étape d’élongation par l’activité 5’ 3’ nucléase de l’ADN polymérase → libère le reporter → on a une fluorescence
3) Quand polymérisation complétée → pour chaque molécule d’ADN synthétisée, un reporter émet de la fluorescence → fluorescence proportionnelle aux taux d’hydrolyse de la sonde hybridée donc à la quantité de produit d’amplification
PCR avec la chimie Sybr Green ?
- Fluorochrome non spécifique → s’accroche sur ttes les séq d’ADN → sondes marquées
- “intercalant” fluorescent quand il est fixé à l’ADN, on mesure la fluorescence en fin d’élongation
Fonctionnement de la chimie SYBR Green ?
- Avant amplification : sybr green émet peu de fluorescence, juste le bruit de fond
- Après amplification : sybr se fixe sur l’ADN double brin → émet une fluorescence donc ↑ du signal
- Emission de la fluorescence mesurée à la fin de chaque cycle d’élongation
- Fluorescence ↓ lorsque l’ADN est dénaturé à l’étape suivante
Quelles sont les applications de la PCR en temps réel ?
- Quantification relative
- Quantification absolue
- Génotypage
- Quantification relative des transcrits