Bioch : ADN recombinant 4

Question 1

Principe de la vérification rapide par restriction ?

Answer 1

Digestion enzymatique par une enzyme de restriction avec un site présent dans l’insert et un site présent dans le plasmide lui même :
=> Où il y l’insert il aura 2 coupures
=> Où il n’y a pas d’insert il n’y en aura qu’une → le plasmide va se linéariser

Question 2

Principe de la vérification par séquençage (méthode de Sanger) ?

Answer 2

=> Permet de déterminer les séquences en
nucléotides par une interruption contrôlée de la réplication.
1) On choisit une amorce pour le séquençage et on initie la synthèse du brin complémentaire de l’ADN à séquencer par l’ADN polymérase 1
2) Synthèse en présence de nucléotides, désoxyribose ET de nucléotides didésoxyriboses → ne sont pas capables de former des liaisons phospho diesters en 3’ → synthèse de la chaîne est bloquée
=> Didésoxyriboses marqués par radioactivité ou par fluorescence afin de permettre la visualisation

Question 3

Pratique de la méthode de séquençage de Sanger ?

Answer 3

1) Prépare 4 milieux réactionnels contenant chacun du didésoxyribose nucléotides
2) Obtient des populations de fragments d’ADN de taille différente en fonction de l’incorporation du didésoxyribose
3) Fait migrer les fragments d’ADN sur un gel de polyacrylamide → séparation en fonction de la taille → didésoxyribose marqués par radioactivité ou par fluorescence

Question 4

Comment lire un gel de séquençage de Sanger ?

Answer 4

On va analyser les différents brins formés sur gel ultra-résolutif => regarde nucléotides par nucléotides
/!\ On commence par celui situé tout en bas (+ petits fragments) et on remonte (+ gros fragments)
/!\ Lecture commence toujours par le 5’
/!\ La séquence qu’on lit sur le gel correspond à la séquence complémentaire du brin d’ADN à séquencer

Question 5

Principe de vérification par séquençage : automatisation du séquençage ?

Answer 5

• Résultats automatiques, + précis et + simples à lire, très rapide
• On excite la réaction de séquençage avec 2 longueurs d’ondes ≠ et l’émission de la fluorescence est mesurée à 4 longueurs
• même technique sauf dNTPs radioactifs sont remplacés par des fluorochromes : A = vert, T = rouge, G = jaune et C = bleu

Question 6

Avantage de l’automatisation du séquençage ?

Answer 6

Permet de faire 1 seule réaction de séquençage en présence des 4 dNTPs

Question 7

Principe des “récepteurs” qui forment les protéines recombinantes ?

Answer 7

• E. coli ++
• Dépourvue de protéases
• Cultivé en grande quantité (fermenteurs)

Question 8

Problème liés à l’utilisation des bactéries pour la production de protéines recombinantes et sa résolution ?

Answer 8

• Pb : fort taux de croissance + synthèse très importante des protéines recombinantes → C meurent rapidement ce qui limite l’expression des protéines recombinantes
• Réso : dissocier la phase de croissance (multiplication des bactéries) et la phase d’expression (amplification de la transcription
  du gène)

Question 9

Quelles sont les contraintes d’utilisation d’un hôte procaryotes pour produire des protéines recombinantes ?

Answer 9

● Nécessité d’un promoteur procaryote pour que la bactérie puisse transcrire le gène d’intérêt (vecteur adéquat)
● La bactérie ne fait pas d’épissage : pb évité par une construction à partir d’un ADNc

Question 10

Avantage de l’utilisation de bactéries pour la production de protéines recombinantes ?

Answer 10

Culture facile et croissance rapide des bactéries

Question 11

Comment est vérifié l’expression des protéines recombinantes ?

Answer 11

prélèvement d’un échantillon de l’extrait bactérien + électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant SDS

Question 12

Caractéristiques du gel polyacrylamide ?

Answer 12

• matrice inerte formant beaucoup de liaisons croisées à travers lesquelles migrent les protéines
• rôle d’un tamis moléculaire
• taille des pores peut être ajustée
  suivant la taille des protéines que l’on souhaite visualiser

Question 13

Mise en place de l’électrophorèse sur gel polyacrylamide ?

Answer 13

1) Prélèvement d’un échantillon de l’extrait bactérien, supposé contenir nos protéines
2) Dénaturation des protéines par mélange
avec du tampon de charge, et chauffage 5min à 95°C
3) Electrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant

Question 14

Caractéristique du tampon de charge (Laemmli) utilisé pour le gel de polyacrylamide ?

Answer 14

Contient :
● glycérol : augmente la densité de l’échantillon + facilite son dépôt dans les puits du gel
● colorant : facilite le suivi de la migration des échantillons sur gel et se dire stop quand on veut
● agents réducteurs : destruction des ponts disulfures des protéines (ex : bétamercapto
éthanol, dithiothreitol (DTT) pour que ces dernières puissent migrer correctement
Un détergent anionique souvent c’est SDS (sodium dodécylsulfate) : fixation sur les régions hydrophobes de la protéine, cela provoque alors son dépliement → la protéine est soluble dans la solution de détergent

Question 15

Relation entre la migration des protéines et leur charges en électrophorèse en condition dénaturante ?

Answer 15

Charge intrinsèque de la protéine masquée par les charges négatives du SDS → migration vers le pôle positif lors de l’application d’une tension

Question 16

Relation entre la migration des protéines et leur tailles en électrophorèse en condition dénaturante ?

Answer 16

• grandes protéines → migrent moins loin car elles sont davantage retenues par le maillage du gel
• petites protéines vont le + loin
  Les protéines sont fractionnées selon leur masse moléculaire

Question 17

Intérêt de l’électrophorèse en conditions dénaturante?

Answer 17

• méthode est très puissante
• Analyses les protéines insolubles dans l’eau, protéines membranaires, protéines de gros agrégats..
• apporte des informations sur la composition des sous-unités d’un complexe protéique

Question 18

Après électrophorèse en condition dénaturantes, comment détecter les protéines fortement exprimées ?

Answer 18

Coloration dans le gel (au bleu de Coomassie ou nitrate d’argent)
=> Détection globale de toutes les protéines fortement exprimées = protéines totales

Question 19

Après électrophorèse en condition dénaturantes, comment détecter les protéines en faible quantité ?

Answer 19

Détection par Western Blot : transfert du gel sur une membrane => détection spécifique (1AC spécifique pour 1 protéine donnée)

Question 20

Principe du transfert sur membrane (analyse des protéines) ?

Answer 20

• Papiers buvards correspondent à des membranes de Wattman → technique de sandwich autour du gel pour pouvoir le transférer dans la membrane
• migration vers la borne positive grâce à un champ électrique
• Déplacement protéines selon le champ électrique, passent du gel à la membrane →
  transfert pendant ± 2 heures

Question 21

Principe d’un Western Blot ?

Answer 21

Reconnaissance spécifique de la protéine qui nous intéresse à l’aide d’un AC dirigé contre cette protéine

Question 22

Déroulé du Westren Blot ?

Answer 22

1) Saturation des sites non spécifiques par incubation avec du lait (ou BSA) → limite la liaison des AC sur des sites non spécifiques
2) Incubation avec l’AC primaire spécifique de la protéine : Reconnaissance de la protéine par l’AC
3) Lavages de la membrane
4) Incubation avec l’AC secondaire : reconnaît et fixe l’AC primaire. 1 enzyme est fixée sur l’AC secondaire
5) Lavages de la membrane
6) Révélation du Western Blot : substrat de l’enzyme est ajouté → réaction enzymatique transforme ce substrat en un produit luminescent/ phosphorescent

Question 23

Comment détecter la lumière des protéines après Wester Blot ?

Answer 23

détectée sur un film photosensible, ou par une caméra

Question 24

Comment est déterminé la taille des protéines en Western Blot ?

Answer 24

Utilisation d’un marqueur de poids moléculaire (en kiloDalton)

Question 25

Utilisation du Southern Blot ?

Answer 25

On révèle les ADN sur la membrane à l’aide de sondes d’ADN complémentaires marquées radioactivement

Question 26

Utilisation du Northern Blot ?

Answer 26

Séquence de l’ARN étudiée, marquées radioactivement (ou chimiquement)

Question 27

Nature de la révélation du Western Blot ?

Answer 27

qualitatif et non quantitatif

Question 28

Pourquoi purifier les protéines recombinantes ?

Answer 28

Car elles sont mélangées avec des protéines bactériennes

Question 29

Quantification des protéines recombinantes dans un extrait cellulaire par Western Blot ?

Answer 29

• pas de quantification absolue, ce n’est pas qualitatif
• données comparatives qualitatives entre différentes conditions
• gène de ménage souvent utilisé comme référence

Question 30

Quantification des protéines recombinantes dans un extrait cellulaire par dosage ?

Answer 30

quantification, méthodes spectroscopiques, immunologiques, enzymatiques

Question 31

Quantification des protéines recombinantes dans un extrait cellulaire par Northern Blot ?

Answer 31

=> Indirectement
information sur la quantité d’ARN messager pouvant correspondre à la protéine

Question 32

Comment localiser notre protéine recombinante dans des cellules ?

Answer 32

Deux possibilités :
1. Regarder la protéine endogène par immunofluorescence
2. Construire une protéine recombinante fusionnée à une protéine fluorescente
=> observation faite avec un microscope à fluorescence des cellules préalablement fixées souvent au paraformaldéhyde (PAF)

Question 33

Comment sont localisées les protéines recombinantes par immunofluorescence ?

Answer 33

=> protéines endogènes
* technique proche du Western blot est utilisée : l’immunofluorescence
* lavages servent à éliminer les anticorps (primaires et secondaires) non fixés

Question 34

Localisation des ARN et ADN ?

Answer 34

• grâce à l’hybridation in situ
• dans une cellule ou coupe de tissus (FISH)
• Utilisation d’une sonde fluorescente d’ADN complémentaire de l’ARN ou l’ADN étudié et visualisation sur un µscope à fluorescence

Question 35

Localisation des ADN chromosomiques ?

Answer 35

préalablement exposés à un fort pH → détruit les appariements de bases de l’ADN → sonde complémentaire de la région étudiée a alors accès à l’ADN

Question 36

Localisation des ARN ?

Answer 36

pas d’exposition à un fort pH pour que l’ADN reste bicaténaire et ne fixe pas la sonde : Fixation douce pour que l’ARN soit conservé dans une forme exposée

Question 37

Exemple de technique permettant de comparer la composition en ARN ?

Answer 37

Les puces à ADN permettent de comparer l’ensemble des ARNm présents dans 2 échantillons différents

Question 38

Principe de la chromatographie d’affinité pour les protéines recombinées ?

Answer 38

Principe générale de la chromatographie d’affinité mettant en jeu un ARN étiqueté MS2

Question 39

Quelles sont les possibles approche de l’ADN recombinant ?

Answer 39

● Approche génétique classique : point de départ, des mutants avec un phénotype intéressant, puis recherche des gènes impliqués
● Approche génétique inverse : possible de cibler une mutation dans une séquence donnée. Cette version mutante peut être transférée dans une cellule pour son étude

Question 40

Principe de l’approche génétique classique ?

Answer 40

Mutagenèse aléatoire → Crible pour identifier un phénotype intéressant → Recherche du/des gènes impliqués

Question 41

Comment est obtenue une version mutée d’un gène ?

Answer 41

● Par PCR mutagène (PCR en présence d’un déséquilibre entre les différents nucléotides
et d’un tampon différent) → mutations aléatoires dans la séquence
● Par mutagenèse dirigée : PCR avec des amorces particulières → insertion d’une mutation à un endroit précis