Bioch : ADN Recombinant 1 Flashcards
Le Pabic
Principe d’obtention de l’ADN recombinant ?
- Organisme donneur : extraction d’un fragment d’ADN d’intérêt
- Le vecteur → sert à intégrer notre fragment d’intérêt
→ But = insérer le fragment d’ADN d’intérêt dans le vecteur pour obtenir un ADN recombinant
Quelles sont les utilisation de l’ADN recombinant ?
- Amplification
- Purification des protéines d’intérêts
- Etude de l’expression et des fonctions des protéines correspondantes
- Localisation des protéines
Définition de l’ADN recombinant ?
Combinaison entre l’ADN d’un organisme donneur et celui d’un vecteur
Définition du génie génétique et technologie de l’ADN recombinant ?
Ensemble des techniques de construction d’un ADN recombinant et ses utilisations
Définition du clonage ?
● Multiplication à l’identique à l’échelle cellulaire (clonage cellulaire) ou à l’échelle de l’organisme tout entier (clonage reproductif)
● Amplification d’un fragment d’ADN par des µ-organismes après son insertion dans un vecteur
Définition d’un vecteur ?
Fragment d’ADN capable de réplication autonome
Quels sont les différents vecteurs existant et la taille des fragments qui leurs sont associer ?
o Plasmide (fragments entre 0,1 et 10kb)
o Soit un phage (fragments entre 10 et 20kb)
o Cosmides (fragments de 50kb)
o YAC (gros fragments d’ADN de 500kb)
Définition d’un plasmide ?
- Fragment d’ADN extra chromosomique,
circulaire - Présent dans les bactéries
- Susceptible de se répliquer de façon autonome
- Se comporte comme un chromosome accessoire
Qu’est-ce qu’un YAC ?
Xsome artificiel des levures
Quelle peut être l’origine de l’ADN de l’organisme donneur pour l’obtention de l’ADN recombinant ?
● ADN génomique (à partir d’une culture cellulaire…)
● ADN complémentaire (ADNc) → par transcription réverse sur des ARN messagers
Intérêt de l’utilisation ADNc pour l’obtention d’ADN recombinant ?
- Plus stable que l’ARN
- Plus facile à utiliser dans les techniques de clonage de protéines recombinantes que ARN
- Ne contient pas les introns → épissés après la transcription de l’ARNm (versus ADN)
Principe de la transcription réverse ?
- Hybridation de la queue poly A avec un oligonucléotide complémentaire de la queue poly A → amorce faite d’oligo-dt (pour eucaryotes)
- Élongation de l’amorce par la transcriptase reverse avec les d’NTPs → brin d’ADNc qui est synthétisé dans le sens 3’ → 5’
- Deuxième brin d’ADNc → obtenue avec PCR réalisée sur l’ADN obtenu avec une ADN polymérase
Qu’est-ce qu’une banque d’ADNc ?
clonage de tous les ADNc exprimés par une C à un moment donnée dans des conditions données
Sur quoi repose la réverse transcription ?
Utilisation d’une enzyme → transcriptase reverse
Déroulé de la réverse transcription ?
(cf schéma page 3)
1. Amorce oligo dT
2. Transcriptase reverse + dNTPs (5’→3’) => boucle en 3’
3. ARNm éliminé par digestion alcaline (soude/RNase H)
4. ADN polymérase I + dNTPs → synthèse 2ème brin 5’→3’
5. Nucléase S1 détruit la boucle en épingle à cheveux
==> ADN complémentaire 2ble brin que l’on peut cloner dans un vecteur plasmidique ou un phage
Par quelle méthode se fait l’amplification du fragment d’ADN d’intérêt ?
PCR → Polymérase Chaine Reaction
Définition de la PCR ?
Réaction de polymérisation en chaîne à partir d’amorces spécifiques de l’ADN d’intérêt, grâce à l’action de l’ADN polymérase dans un milieu contenant des nucléotides
Quels sont les différents types de PCR ?
- PCR conventionnelle : qualitatif
- Cinétique de la PCR : quantitatif
Axes de la courbe de la PCR classique ?
Nb de copies de l’ADN en fonction du nombre de cycles de PCR
Définition des amorces ?
= séquences de nucléotides complémentaires de l’extrémité de la région à amplifier
Déroulé de la PCR conventionnelle ?
- Dénaturation à 95° : L’ADN double brin dénaturé pour avoir 2 ADN simple brin : Δ casse les liaisons hydrogènes entre les 2 brins
- Hybridation : amorces vont s’hybrider, la T° d’hybridation (Tm) dépend de la séquence des amorces
- Élongation : à 72°C avec la TAQ (thermophilus aquatiqus) polymérase uniquement dans le sens 5’→ 3’ pour obtenir 2 ADN double brin pour un cycle
Quelles sont les différentes étapes de la PCR conventionnelle ?
● Extraction de l’ADN
● L’amplification de l’ADN avec la PCR
● Révélation par électrophorèse sur gel d’agarose (1-2%) : l’ADN est phosphorescent quand excité aux UV, s’il est chargé - il va migrer de la borne - vers la borne +
Quelles sont les phase de la courbe de la cinétique de la PCR ?
4 phases :
→ amplification, non détectable au départ : phase de latence
→ phase exponentielle : on peut évaluer la quantité de copies d’ADN que l’on a
→ phase linéaire
→ phase de plateau, on n’aura pas plus de copies
Différence entre la PCR classique en point final et en temps réel ?
- PCR classique en réaction en point final (= avec une phase de plateau vers la fin) est
qualitative - PCR en temps réel, est quantitative et très précise
Quels sont les besoins de la TAQ polymérase pour fonctionner ?
l’ion Mg2+ pour fonctionner → ajout d’MgCl2 dans le milieu
Calcul de la Température d’annealing : Tm ?
Tm = 2 x (A+T) + 4 x (G+C)
+1°C pour les combinaisons GG, CC, GC
- 1°C pour les combinaisons AA, TT, AT
Caractéristiques du 1er cycle de PCR ?
- L’enzyme continue de fonctionner : ne s’arrête pas quand elle se trouve du côté
des amorces qui sont en face → nucléotides qui se prolongent de chaque côté - Fin du 1er cycle = aucune molécule obtenue qui correspond au produit qu’on voulait → séq de part et d’autre ≠ de ce que l’on cherche
- Nouveau cycle de PCR commence
Caractéristiques du 2ème cycle de PCR ?
- Séq de part et d’autre de la séq qu’on veut amplifier
- On obtient les complémentaires des brins obtenus lors du 1er cycle
- Produits qu’on ne désirait pas, aucune ne
représente le produit désiré - On lance un troisième cycle de PCR
Caractéristiques du 3ème cycle de PCR ?
- 2 produits de PCR attendus apparaissent : doubles brins qui correspondent aux séq qu’on voulait spécifiquement
- Ces produits vont se multiplier de façon exponentielle par rapport aux produits non souhaités
Caractéristiques du 4ème cycle de PCR ?
- Les 2 molécules d’intérêt obtenues au 3ème cycle donnent chacune 2 molécules d’ADN
d’intérêt - 4 fragments simple brin des autres molécules pourront donner un produit PCR souhaité
- 8 fragments d’ADN
- Au 5ème cycle, on aura 22 fragments d’intérêt etc…
→ Il faut au max 30 cycles pour avoir une amplification spécifique (min 20 cycles)
Quelles sont les étapes qui compose chaque cycles de PCR ?
dénaturation, hybridation des amorces et élongation (la machine à PCR fait des cycles de T°)
Quelles sont les ADN polymérases utilisée pour la PCR et pourquoi ?
- TAQ polymérase provient de Thermophilus aquaticus
- PFU polymérase provenant de Pyrococcus furiosus : + spécifique, + fidèle que la TAQ, beaucoup + lente et + chère
==> L’ADN polymérase ne doit pas être dénaturée à 95°C : on utilise de l’ADN polymérase de bactéries thermophiles
