Bioch : ACIDES NUCLEIQUES (3)

Question 1

Que doivent respecter les oligonucléotides antisens pour être utiles en thérapie ?

Answer 1

● Être en mesure d’entrer dans les cellules et d’aller dans le noyau éventuellement
○ on l’associe à un dispositif de ciblage :
■ Empaqueter dans des vésicules (=nanoparticules) : ex : vaccins ARN
■ Un ligand pour le type de rc présents sur les cellules cibles désirées
■ Des Ac dirigés contre les molécules de surface des cellules cibles souhaité
● Éviter la digestion par les nucléases plasmatiques (différents moyens)
■ en culture in vitro
■ Intégration dans les génomes : mauvais substrats pour les ADN
polymérases : compliqué
d’intégrer dans le génome
■ Dégradation en molécules toxiques / cancérigènes ( =risque)

Question 2

Actions possibles des ASO dans le noyau ?

Answer 2

• Se lier à l’ADN
• Recruter, au niveau de l’ADN, la RNase H
• Inhiber la formation de la coiffe en région 5 ’=> le ribozyme ne reconnait pas l’ARN
• Jouer sur épissage : région splicing

Question 3

Action possible des ASO dans le cytoplasme ?

Answer 3

• Système blocker
• Système cliver

Question 4

Intérêt du saut d’exon ?

Answer 4

Utile pour pouvoir jouer sur l’épissage d’un ARN messagers

Question 5

Quelles peuvent être les causes de situations pathologiques causées par un problème au niveau de l’exon ?

Answer 5

• Mutation :
  
  • Si sur la 3e base du codon : aucun impact en général => Modification de la séquence génétique sans impact sur la séquence protéique
  • Modification de la séquence protéique => Modification d’un AA
  • Modification du cadre de lecture : Génération d’un codon stop plus ou moins tôt en aval par modification de la séquence type => Délétion, Insertion de séquence

Question 6

Principe du saut d’exon ?

Answer 6

on va faire en sorte que l’exon soit considéré comme intron => que s’il y a décalage de lecture et donc
apparition d’un codon stop

Question 7

Application du saut d’exon en thérapeutique ?

Answer 7

Traiter la myopathie de Duchenne :
liée à une anomalie du gène dmd responsable de la production d’une protéine impliquée dans le soutien de la fibre musculaire, la distrophine

Question 8

A quoi faut-il être attentif lors d’un saut d’exon ?

Answer 8

Parfois il est nécessaire d’enlever plusieurs exons pour retrouver un bon cadre de lecture :
Il vaut mieux faire un saut d’exon et perdre quelques AA, que de laisser le codon stop plus tôt, et ne pas avoir la traduction de la fin de l’ARN

Question 9

Exemple d’ASO utilisés pour le ttt de la dystrophie de Duchen ?

Answer 9

• drisapersen (abandon)
• eteplirsen
• SRP-4053
• Viltolarsen

Question 10

Quels sont les limites des essais cliniques pour le développement d’ASO pour le ttt de la myopathie de Duchenne ?

Answer 10

ASO peuvent être utilisés pour tous les exons, excepté le 1e et le dernier, car il n’y a rien en amont ou en aval
On peut traiter que du 2e au 78e exons

Question 11

Comment le saut d’exon associé à la thérapie génique est mis en place ?

Answer 11

Oligonucléotides antisens, au lieu d’être injectés isolement, sont transportés par un vecteur viral => permet de faire produire par les cellules musculaires elles-mêmes les oligonucléotides antisens
thérapeutiques

Question 12

Caractéristique du mipomersen ?

Answer 12

• ASO de 2e génération
• modification de sucre 2’MOE confère une meilleure stabilité au médicament et augmente également l’affinité pour l’ARN cible jusqu’à atteindre une affinité dix fois supérieure

Question 13

Rôle du mipomersen ?

Answer 13

Chaine phosphorothiate réduit la vitesse de dégradation par les nucléases, améliore la distribution aux tissus en se liant aux protéines plasmatiques, et « prend également en charge » l’activité RNase H, du fait d’une faible modification au sein de la molécule.

Question 14

Utilisation du mipomersen ?

Answer 14

Molécule a été développée pour le ttt des hypercholestérolémies en complément des statines. Elle a un effet inhibiteur de la synthèse d’apolipoprotéines B. L’idée est de baisser statistiquement significative des taux de LDL-C

Question 15

Utilisation des oligonucléotides ?

Answer 15

• Stratégies antisens et ribozymes contrôlent l’expression au niveau traduction
• Stratégies antigène (blocage d’un gène) et sens (blocage d’un facteur de transcription) : champs
  d’application étendu au niveau transcriptionnel de l’expression génique.
• Aptamère : oligonucléotides synthétisés aléatoirement et sélectionnés pour leur affinité à une cible
  protéique

Question 16

Caractéristiques des ribozymes ?

Answer 16

• Centre catalytique constitué d’ARN, ne requiert pas de protéines pour la catalyse
• structures chimiques et réactions métaboliques associées au mécanisme de catalyse «acide-base» conservé

Question 17

Utilisation de séquences de guidages externes (EGSs) ?

Answer 17

Thérapie via le clivage d’ARN cible dérivé de la connaissance de la ribonucléase P

Question 18

Fonctionnement des EGSs ?

Answer 18

EGS forme un complexe avec l’ARN cible mimant la structure du pré-ARNt, lequel est reconnue par la RNase P. La RNase P clive l’ARN cible dans sa partie 5’ libérant l’EGS et l’ARN

Question 19

Mécanisme d’action des ECGs ?

Answer 19

⇨ Phénomène de catalyse – système de cinétique enzymatique
1) Liaison
2) Reconnaissance comme substrat
3) RNase P coupe la cible sans couper le morpholino. Ainsi le morpholino n’est pas encore dégradé, ainsi il peut se lier à nouveau sur une nouvelle molécule. C’est comme un système de cinétique enzymatique ou le mopholino ne va jamais être dégrader au cours du processus de clivage

Question 20

Quelles sont les modification chimiques réalisables pour améliorer la stabilité et l’internalisation des ECGs ?

Answer 20

• Substitution du ribose par un noyau morpholine
• Remplacement de la fonction phosphodiester par un phosphorodiamidate => PMO
• Liaison covalente avec un peptide basique (CPP) => CPP-PMO
  ⇨ Favorise l’entrée dans la cellule

Question 21

Comment voir si l’ECGs fonctionne ?

Answer 21

on peut coupler la PMO à un fluorochrome
1. Parasite non traité
2. Parasite traité avec un PMO fluorescent
3. Dès 30 minutes d’incubation on a de la fluorescence dans le parasite
4. À 90 minutes la fluorescence est bien incorporée et est vraiment au niveau du parasite et pas au niveau de l’érythrocyte
- Les conjugués pénètrent rapidement le parasite
- Les conjugués inhibent la croissance de P. falciparum et réduisent l’expression de PfgyrA

Question 22

Principe de la triple hélice ?

Answer 22

Se déroule dans le noyau.
1. ADN simple brin qui lie spécifiquement le grand sillon de l’ADN double brin Dans le grand sillon c’est la ou il y a le plus d’espace,
donc c’est la ou la transcription va être lancée
2. Formation d’une triple hélice locale
3. Inhibition de la transcription par impossibilité de séparer les brins

Question 23

Problème de la technique de la triple hélice ?

Answer 23

Le problème de cette technique est que l’on est
limitée à des séquences cibles de type oligopurine oligopyrimidine

Question 24

Caractéristiques des leurres à protéines ?

Answer 24

• Petites séquences d’ADN en double brin
• Reconnues par une protéine tel que facteur de transcription par exemple
• Inhibition de la transcription des gènes
• Fonctionne avec des oligodésoxynucléotides phosphorothioates
• Seule la connaissance de la séquence consensus reconnue est nécessaire
  o Par technique d’emprunte à l’ADNase

Question 25

Utilisation des leurres à protéines dans le VIH ?

Answer 25

Activité antivirale d’ON en épingle pour piéger l’integrase du VIH
1. L’oligonucléotides en structure tige-boucle (oligo-IN) mime les
extrémités du LTR reconnues par l’intégrase du VIH
Contrôle : oligonucléotide INC dans lequel la boucle a été placée
à l’autre extrémité de la tige et le dinucléotide CA, essentiel à
l’intégration, a été muté
2. Activité antivirale de ces oligonucléotides, métaboliquement
stables déterminée en dose-réponse sur modèle d’infection de
cellules CEM infectées par le VIH. L’activité comparée à celle d’un
oligonucléotide antisens en simple brin complémentaire du site
d’initiation de la traduction de l’ARNm de TAT (oligo-TAT) et à celle de l’AZT

Question 26

Caractéristiques des aptamères ?

Answer 26

• Pas vraiment un ASO
  o ASO en fonction de l’interaction que l’on va
  avoir avec la cible
  o pas un ASO car interagit avec une proteine au n’importe quelles molécules
• Séquence simple brin ADN ou ARN de 5 à 70 bases
• Structure secondaire ou tertiaire avec haute affinité et spécificité
• Cible variées : protéines, peptides, acides nucléiques, petites molécules organiques (inorganique), cellules intactes → peut cibler à peu près tout
  o On décide quelle est la cible
  o Puis on cherche à designer un aptamère

Question 27

Avantage des aptamères ?

Answer 27

• Facile à synthétiser
• Identifier dans des banques d’oligonucléotides par le processus SELEX
  o Fabrication de séquences aléatoires
  o Sélection par le processus SELEX : recherche de la séquence qui va taper sur la cible

Question 28

Principe de l’utilisation des aptamères ?

Answer 28

1. Génération de toutes les séquences possibles => fabrication de la banque de façon très aléatoire
2. Espoir que dans cette banche il y a au moins une molécule qui aie une affinité pour la cible
3. Elimination par lavage des molécules les molécules les moins affine
4. Récupération des molécules les plus affine
5. Système d’amplification de réamplification pour faire de nouveau un cycle de sélection pour n’avoir
   plus qu’une seule molécule à la fin
6. La séquence de l’aptamère est alors amplifiée par PCR ou RT-PCR
7. Test pour savoir s’il y a une visée thérapeutique
   ⇨ Stratégie différente des antisens classiques

Question 29

Protéines cibles des aptamères ?

Answer 29

• Thrombine
• HIV tat
• HIV rev
• Factore IX
• VEGF
• PDGF
• Ricin
• Large glycoproteines such as CD4
• Anthrax spores

Question 30

Propriétés des aptamères ?

Answer 30

• Anticoagulantes
• Anti-angiogéniques et antitumorales
• Antivirales et anti-infectieuses
• Antiprolifératives
• Anti-inflammatoires et modulatrices du SI