vid.terapia genica Flashcards
es una tecnologia que utiliza enzimas para cortar y pegar secuencias de adn de interes
tecnoliga de adn recombinante
es el proceso de utilizar tecnologia de adn recombinante (adnr) para alterar la composicion genetica del organismo
ingenieria genetica
disciplina cuyo objetivo es la cura o control de enfermedades mediante modificacion genetica
terapia genica
en el futuo esta tecnica, podria permitir a los medicos tratar un transtorno mediante la
insercion de un gen en las ceulas de un paciente en vez de usar medicamentos o cirugia
la tecnica sigue siendo arriesgada y todavia esta bajo estudio para asegurarse de que sea
seguro y eficaz
actualmente solo para enfermedades sin otras
curas
ensayos clinicos de terapia genica
-anemia depranocitica
-epidermolisis bullosa
-hemofilia
-degeneracion macular asociada a la edad
-aprobacion fda de la primera terapia contra cancer raro de medula osea y linfoma
fases de estudios clinicos
1
2
3
4
fase 1
¿es seguro?
15-50 sujetos
-primera serie de ensayos en humanos
-voluntarios sanos
-no suele contar con grupo control
-determinar su accion, seguridad, via de administracion y dosis
-farmacodinamia y farmacocinetica
fase 2
¿funciona?
50-200
-evaluacion terapeutica, efectividad y seguridad en pocos casos
-identificacion de efectos secundarios
-generalmente tampoco hay grupo control
etapa 3
¿es mas eficaz que lo que tenemos actualmente?
500-10 000
-evaluacion en un tiempo mayor (duracion promedio de 3 años) y en diferentes poblaciones
-mayor costo
-evaluacion terapeutica, seguridad y dosis en mayor numero de enfermos
-a menudo, multicentricos
etapa 4
¿existen otros usos o beneficios?
farmacovigilancia
-el medicamento ya esta disponible en el mercado
-seguridad y eficaci a largo plazo
-reporte de posibles efectos adversos raros (frecuencia -1/1000)
modificacion de la expresion genica
-inhibicion de la expresion
-edicion genica
-adicion genica
-knock out
-eliminar (o reducir RNAi) la expresion de genes causantes de la enfermedad
-la terapia antisentido no es estrictamente terapia genica, es terapiia mediada geneticamente
inhibicion de la expresion
-reparar el genoma del paciente mediante tecnicas que involucran recombinacion homologa
edicion genica
-introducir material genetico exogeno para expresar los genes terapeutica
adicion genica
vectores no virales no integrativos
-no se integran en el genoma
-faciles de producir y controlar
alta seguridad
vectores no virales no integrativos
-celulas madre y primarias muy resistentes a modificacion genetica
-la expresion transitoria, se pierde con sucesivas divisiones celulares
baja eficacia
vectores no virales no integrativos
-alta seguridad
-baja eficacia
vectores no virales integrativos
el adn no solo expresar el gen terapeutico, ademas contiene:
-transposon
-nucleasas especificas
transposon
requerido para la integracion del adn (sleeping beauty)
nucleasas especificas
ZFNs
TALEN
CRISP/cas9
secuencia de adn que puede moverse de manera autonoma a diferentes partes del genoma de una celula (transposicion)
transposon
transposon
contienen una secuencia central con informacion para la
transposasa, enzima necesaria para la transposicion y en los extremos una secuencia repetida en orden inverso
transposon
se inegra a un determinado punto del adn, secuencias ricas en
TA
transposon
la proteina verde fluorescente(GFP) emite fluorescencia en la
zona verde del espectro visible
transposon
el gen que codifica para esta proteina esta aislado y se utiliza habitualmente en biologia molecular como gen
reporteto
transposon
se pueden construir quimeras con
otras proteinas
nucleasas especificas
generan rupturas en sitios especificos del dna
-NHEJ
-HR
-Citotoxicidad por cortes inespecificos
-ZFNs
-TALENs
-CRISPR/cas9
NHEJ (union de extremos no homologos)
inhibicion de la expresion
HR (recombinacion homologa)
edicion genica
adicion genica
-se unen a pequeños dominios de union al dna (3 a 6 ZF de -30 aa c/u) para reconocer una secuencia mas larga (9 a 18pb)
-se fusionan con nucleasa mediante un conector de 4 aa
ZFNs (zinc finger nucleases)
TALENs (transcriptor activator-like effector nucleases)
las proteinas de tipo activador transcripcional (TAL) reconocen secuencias de adn a traves de
un dominio que consiste en numero variable de repeticiones de -34 aa
RVD repeat variable di-residue (12-13)
TALENs (transcriptor activator-like effector nucleases)
parece hacer una correspondencia uno a uno entre la identidad de 2 aa criticos en cada
repeticion y cada base de adn en la secuencia objetivo
CRISPR
clustered regulary interspaced short palindromic repeats
cas9
crispr associated protein 9
-endoucleada guiada por rna
-escinde secuencias que se unen al crRNA (crispr rna), region espaciadora de 20nt
gRNA (guide rna)
crRNA/tracrRNA
CRISPR/cas 9
-crispr
-cas9
-gRNA
variantes de cas 9
-dominios nucleasa RuvC y HNH activos independientes (incremento de la especificidad de corte)
-dCas9 con ambos dominios nucleasa inactivos para otras aplicaciones (ej silenciamiento/activacion genica)
vectores no virales integrativos
ventajas
facilidad de produccion
¿seguridad biologica?
vectores no virales integrativos
limitaciones
-baja eficiencia en celulas diana de relevancia para terapia genica
-la region de integracion es al azar (transposon)
la desventaja global de los vectores no virales es la baja eficiencia
en la transfeccion
vectores virales
por otro lado, los virus son muy eficientes introduciendo su propio material genetico en las celulas diana y
utilizando la maquinaria celular para producir nuevas particulas virales
vectores virales
-no integrativos
-integrativos
no integrativos (mayor seguridad/expresion transitoria)
-adenovirus
*dsDNA. capacidad de infectar todo tipo de celulas
permiten insertos de hasta 8kb
integrativos
-retrovirus
-adenoasociados
integrativos
retrovirus
-rna. aplicaciones limitadas a celulas en division
-riesgo de recombinacion con otros retrovirus y oncogenes
-manipulacion sencilla y prescisa evita esos problemas
integrativos
adenoasociados
-ssDNA
-endocitosis
-muy simple y no autonomo que requiere la coinfeccion con adenovirus u otros para replicarse
-no esta asociada con ninguna enfermedad conocida
-menos inmunogenicos que los adenovirus
primeros vectores virales integrativos desarrollados
moloney murine leukemia virus (mlv)-based vectors
vectores virales integrativos
ventajas
-alta eficacia de transduccion
-se integra eficientemente en una amplia gama de celulas humanas
-faciles de manipular
vectores virales integrativos
desventajas
-baja seguridad biologia
-baja/nula eficiencia en celulas quiescentes
-alta genotoxicidad (alteracion de la expresion de otros genes por insercion)
